鄧青南 周建龍 郭振輝

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院（廣東廣州510010）

內(nèi)毒素性急性肺損傷（ALI）臨床上表現(xiàn)為肺水腫及肺不張引起的呼吸急促，如果得不到及時(shí)有效的治療，最終將會(huì)形成急性呼吸窘迫綜合征，造成機(jī)體不可逆的急性呼吸功能衰竭?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要是采取大劑量激素沖擊療法配合細(xì)胞因子拮抗劑，中性粒細(xì)胞蛋白分解酶抑制劑，抗氧化劑等方法，療效欠佳。中藥治療內(nèi)毒素性肺損傷有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前主要為清熱解毒、活血化瘀等方法［1-2］。自第一個(gè)水通道蛋白AQP1被發(fā)現(xiàn)以來，有關(guān)AQP的分布及其維持細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)平衡中的作用日益受到重視。本實(shí)驗(yàn)通過脂多糖（LPS）復(fù)制ALI模型，探討清氣化痰湯和AQP1的相關(guān)性及清氣化痰湯治療ALI的機(jī)制。

1 材 料

健康昆明種小鼠24只，雄性，體質(zhì)量18～20g，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。脂多糖（LPS，美國Sigma公司）； AQP1、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）引物由上海生工提供。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司）。清氣化痰湯組成：瓜蔞仁 18g，杏仁 18g，枳實(shí) 18g，陳皮 18g，黃芩 18g，茯苓18g，制半夏27g，膽南星27g（由廣州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供，自行煎制）。

2 方 法

2.1 ALI動(dòng)物模型制備 將24只小鼠隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，清氣化痰湯組。給小鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為200μg/mL的 LPS（10mg/kg）建立 ALI模型，對(duì)照組予以等量的生理鹽水作為對(duì)照。在6h時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，并立即解剖肺組織，左上肺進(jìn)行濕重/干重比（w/d）檢測(cè)，左中下行石蠟包埋，并制成病理切片。右肺制成肺組織勻漿行PCR檢測(cè)。

2.2 w/d的測(cè)定與肺組織病理觀察 稱取左上肺濕重 （w）后，置70℃恒溫箱，24h后稱干重（d），計(jì)算w/d。肺組織經(jīng)過10%的甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察ALI的病理變化。

2.3 RT-PCR檢測(cè)肺組織AQP1、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)。引物序列分別為：AQP1上游引物：CTGGCCTTTGGTTTGAGCGT，AQP1下游引物：CCACACACTGGGCGATGAT，片段長度為149bp；TNF-α 上游引物：AGCCGATGGGTTGTA，TNF-α 下游引物：ACTTGGGCAGATTGA，片段長度為266bp；IL-1β上游引物：GCTTCAGGCAGGCAGTAT，IL-1β 下游引物：ACAAACCGCTTTT CCATCT， 片段長度為 475bp；β-actin上游引物：CTGTCCCTGTATGCCTCTG，IL-1β 下游引物：ATGTCACGCACGATTTCC，片段長度為 218bp；AQP1的 PCR擴(kuò)增條件：94℃變性 55s，53.5℃退火 56s，72℃延伸 55s，循環(huán) 35 次，72℃擴(kuò)增 5min，TNF-α 的退火溫度為53.5℃，其余條件相同。IL-1β的退火溫度為53.5℃，其余條件相同。β-actin的退火溫度為53.5℃，其余條件相同。長波紫外燈下觀察并照相，Bio Rad成像系統(tǒng)分析電泳條帶，Quantity One圖像分析軟件計(jì)算 AQP1、TNF-α、IL-1β 的 mRNA與 βactin mRNA比值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以表示，組間差異的比較采用one-way ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 肺大體觀察 空白對(duì)照組、清氣化痰湯組肺外觀均無明顯異常改變。模型對(duì)照組肺體積增大，暗紅色，散在有大小不一紅色斑點(diǎn)，切片疏松，有淡紅色液體滲出。

3.2 肺病理觀察 空白對(duì)照組、清氣化痰湯組光鏡下示肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，無明顯異常。模型對(duì)照組光鏡下肺泡壁充血增厚，肺泡間隔增寬，腔內(nèi)有少許出血、滲出及炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)充血水腫，有大量炎性細(xì)胞浸潤（見圖1）。

圖1 各組肺病理組織圖（HE染色）

3.3 肺w/d 模型對(duì)照組的肺w/d值較空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），清氣化痰湯組較模型對(duì)照組均明顯改善（P＜0.05）（見表 1）。

3.4 AQP1mRNA、TNF-αmRNA和 IL-1βm RNA的表達(dá) RTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示：模型對(duì)照組大鼠肺組織AQP1 mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯降低 （P＜0.01），清氣化痰湯組肺組織AQP1 mRNA的表達(dá)較模型對(duì)照組明顯回升（P＜0.05）。模型對(duì)照組大鼠肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高 （P＜0.05），清氣化痰湯組肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）（見表 2，圖 2）。

表1 各組w/d比值的比較

表1 各組w/d比值的比較

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

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圖2 PCR電泳結(jié)果

表 2 各組 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)比較

表 2 各組 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)比較

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4 討 論

嚴(yán)重感染是最常見的原因，其中內(nèi)毒素性ALI是臨床上常見的危重病癥，許多疾病都容易并發(fā)內(nèi)毒素性ALI。其病理特征主要是肺組織水腫及肺不張，細(xì)胞上表現(xiàn)為多種炎性因子和炎癥介質(zhì)的過度釋放，促炎抗炎反應(yīng)失衡。近年研究表明，肺臟的液體平衡遭到破壞，通透性增高導(dǎo)致產(chǎn)生肺水腫與水通道蛋白密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為感染、炎癥等多屬溫?zé)岵》懂牎７螢閶膳K，為五臟之華蓋，病邪入侵，常先傷肺，邪毒壅肺，肺失宣降，氣不布津，又致病理產(chǎn)物內(nèi)聚，機(jī)體炎癥反應(yīng)加重，病變由肺而累及全身，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識(shí)甚為相似。中藥或復(fù)方常常是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑、多機(jī)制發(fā)揮作用，對(duì)于綜合調(diào)控復(fù)雜的炎癥反應(yīng)更具優(yōu)勢(shì)［3］。

AQPs是對(duì)水有特異性轉(zhuǎn)運(yùn)功能的細(xì)胞膜通道蛋白，人類和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有10個(gè)亞型，分布在肺、腎、眼部。其中已知在肺組織和氣道至少有 4 種 AQPs （AQP1、AQP3、AQP4、AQP5）表達(dá)并參與肺液體轉(zhuǎn)運(yùn)，其中，與肺損傷關(guān)系最密切的研究主要以AQP5和AQP1為主。

AQP1主要在氣道周圍毛細(xì)血管、淋巴管及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和臟層胸膜間皮細(xì)胞上表達(dá)，主要負(fù)責(zé)清除支氣管和脈管周圍組織的內(nèi)水分［4］。AQP5主要表達(dá)在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞及氣道分泌上皮頂質(zhì)膜，作用主要是清除肺泡腔內(nèi)水分［5］。AQP1、AQP5特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)水分子，其他溶質(zhì)和分子則不能通過，有效維持血管與間質(zhì)之間水平衡［4］。與野生型小鼠相比，AQP1或AQP5基因敲除小鼠肺泡毛細(xì)血管間水的滲透性、通透性均降低約10倍。AQP1和AQP5均敲除小鼠肺泡毛細(xì)血管間水的滲透性、通透性降低約25～30倍左右［6-7］。AQPs在各種原因形成的肺損傷肺水腫中起重要作用。腺病毒感染小鼠毒造成病毒性肺炎，肺水明顯增加，在病毒感染后7d和14d分別檢測(cè)AQP1和AQP5，發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)量均有顯著降低，但在14天時(shí)AQP1的表達(dá)有所回升，同時(shí)與炎癥反應(yīng)減輕相一致，提示AQPs的減少可能是肺水在肺間質(zhì)聚集的重要原因，表明AQPs可能在病毒感染后的肺水腫中起主要作用［8］。譚利平［9］研究發(fā)現(xiàn)，與空氣對(duì)照組相比，高氧暴露不同時(shí)間后，AQP5特異性表達(dá)部位保持不變，但隨暴露時(shí)間延長，AQP5表達(dá)呈逐漸減弱趨勢(shì)，推測(cè)高氧肺損傷時(shí)AQP5表達(dá)降低，可能是高氧肺損傷肺水腫形成的原因之一。ALI/ARDS病理過程中，AQP1、5表達(dá)下調(diào)，肺泡-毛細(xì)血管間水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致液體在肺泡腔、肺間質(zhì)的積聚，從而使肺泡腔、肺間質(zhì)水腫加重，可能參與了肺水腫時(shí)液體的異常轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)肺損傷后AQP1、5在調(diào)節(jié)肺內(nèi)液體平衡中起一定作用，可能參與了肺水腫的發(fā)病機(jī)制［10］。高巨［11］首次觀察到失血性休克和內(nèi)毒素刺激下大鼠肺組織AQP5的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，肺組織損傷嚴(yán)重，提示二次打擊后機(jī)體清除肺間質(zhì)和肺泡腔過多水分的能力明顯減弱，肺泡-毛細(xì)血管膜水通透性顯著降低。與此相對(duì)應(yīng)，二次打擊后該組的肺組織含水量也明顯增加。

本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組大鼠w/d值較空白對(duì)照明顯增大，出現(xiàn)肺間質(zhì)水腫同時(shí)AQP1表達(dá)明顯下調(diào)，經(jīng)清氣化痰湯治療后，大鼠肺損傷肺水腫改善，同時(shí)AQP1表達(dá)上調(diào)。炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)與AQP1表達(dá)結(jié)果相反。實(shí)驗(yàn)證明肺水腫吸收障礙可能有與AQP1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。清氣化痰湯可通過增加肺毛細(xì)血管和淋巴管AQP1的表達(dá)，提高肺間質(zhì)水腫液的跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)運(yùn)，促使水從肺間質(zhì)回流到血管系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)肺水腫的吸收，可達(dá)到治療ALI的目的。本研究發(fā)現(xiàn)清氣化痰湯上調(diào)AQP1的表達(dá)，可能是通過下調(diào)TNF-α、IL-1β等表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

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