鄧青南 周建龍 郭振輝
廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院(廣東廣州510010)
內(nèi)毒素性急性肺損傷(ALI)臨床上表現(xiàn)為肺水腫及肺不張引起的呼吸急促,如果得不到及時(shí)有效的治療,最終將會(huì)形成急性呼吸窘迫綜合征,造成機(jī)體不可逆的急性呼吸功能衰竭?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要是采取大劑量激素沖擊療法配合細(xì)胞因子拮抗劑,中性粒細(xì)胞蛋白分解酶抑制劑,抗氧化劑等方法,療效欠佳。中藥治療內(nèi)毒素性肺損傷有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),目前主要為清熱解毒、活血化瘀等方法[1-2]。自第一個(gè)水通道蛋白AQP1被發(fā)現(xiàn)以來,有關(guān)AQP的分布及其維持細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)平衡中的作用日益受到重視。本實(shí)驗(yàn)通過脂多糖(LPS)復(fù)制ALI模型,探討清氣化痰湯和AQP1的相關(guān)性及清氣化痰湯治療ALI的機(jī)制。
健康昆明種小鼠24只,雄性,體質(zhì)量18~20g,由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。脂多糖(LPS,美國Sigma公司); AQP1、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)引物由上海生工提供。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)。清氣化痰湯組成:瓜蔞仁 18g,杏仁 18g,枳實(shí) 18g,陳皮 18g,黃芩 18g,茯苓18g,制半夏27g,膽南星27g(由廣州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供,自行煎制)。
2.1 ALI動(dòng)物模型制備 將24只小鼠隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,清氣化痰湯組。給小鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為200μg/mL的 LPS(10mg/kg)建立 ALI模型,對(duì)照組予以等量的生理鹽水作為對(duì)照。在6h時(shí)間點(diǎn)處死小鼠,并立即解剖肺組織,左上肺進(jìn)行濕重/干重比(w/d)檢測(cè),左中下行石蠟包埋,并制成病理切片。右肺制成肺組織勻漿行PCR檢測(cè)。
2.2 w/d的測(cè)定與肺組織病理觀察 稱取左上肺濕重 (w)后,置70℃恒溫箱,24h后稱干重(d),計(jì)算w/d。肺組織經(jīng)過10%的甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)切片,HE染色,光鏡下觀察ALI的病理變化。
2.3 RT-PCR檢測(cè)肺組織AQP1、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)。引物序列分別為:AQP1上游引物:CTGGCCTTTGGTTTGAGCGT,AQP1下游引物:CCACACACTGGGCGATGAT,片段長度為149bp;TNF-α 上游引物:AGCCGATGGGTTGTA,TNF-α 下游引物:ACTTGGGCAGATTGA,片段長度為266bp;IL-1β上游引物:GCTTCAGGCAGGCAGTAT,IL-1β 下游引物:ACAAACCGCTTTT CCATCT, 片段長度為 475bp;β-actin上游引物:CTGTCCCTGTATGCCTCTG,IL-1β 下游引物:ATGTCACGCACGATTTCC,片段長度為 218bp;AQP1的 PCR擴(kuò)增條件:94℃變性 55s,53.5℃退火 56s,72℃延伸 55s,循環(huán) 35 次,72℃擴(kuò)增 5min,TNF-α 的退火溫度為53.5℃,其余條件相同。IL-1β的退火溫度為53.5℃,其余條件相同。β-actin的退火溫度為53.5℃,其余條件相同。長波紫外燈下觀察并照相,Bio Rad成像系統(tǒng)分析電泳條帶,Quantity One圖像分析軟件計(jì)算 AQP1、TNF-α、IL-1β 的 mRNA與 βactin mRNA比值。
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以表示,組間差異的比較采用one-way ANOVA方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 肺大體觀察 空白對(duì)照組、清氣化痰湯組肺外觀均無明顯異常改變。模型對(duì)照組肺體積增大,暗紅色,散在有大小不一紅色斑點(diǎn),切片疏松,有淡紅色液體滲出。
3.2 肺病理觀察 空白對(duì)照組、清氣化痰湯組光鏡下示肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整,無明顯異常。模型對(duì)照組光鏡下肺泡壁充血增厚,肺泡間隔增寬,腔內(nèi)有少許出血、滲出及炎性細(xì)胞浸潤,肺間質(zhì)充血水腫,有大量炎性細(xì)胞浸潤(見圖1)。
圖1 各組肺病理組織圖(HE染色)
3.3 肺w/d 模型對(duì)照組的肺w/d值較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.01),清氣化痰湯組較模型對(duì)照組均明顯改善(P<0.05)(見表 1)。
3.4 AQP1mRNA、TNF-αmRNA和 IL-1βm RNA的表達(dá) RTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示:模型對(duì)照組大鼠肺組織AQP1 mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯降低 (P<0.01),清氣化痰湯組肺組織AQP1 mRNA的表達(dá)較模型對(duì)照組明顯回升(P<0.05)。模型對(duì)照組大鼠肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高 (P<0.05),清氣化痰湯組肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.05)(見表 2,圖 2)。
表1 各組w/d比值的比較
表1 各組w/d比值的比較
與模型對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。下同。
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圖2 PCR電泳結(jié)果
表 2 各組 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)比較
表 2 各組 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)比較
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嚴(yán)重感染是最常見的原因,其中內(nèi)毒素性ALI是臨床上常見的危重病癥,許多疾病都容易并發(fā)內(nèi)毒素性ALI。其病理特征主要是肺組織水腫及肺不張,細(xì)胞上表現(xiàn)為多種炎性因子和炎癥介質(zhì)的過度釋放,促炎抗炎反應(yīng)失衡。近年研究表明,肺臟的液體平衡遭到破壞,通透性增高導(dǎo)致產(chǎn)生肺水腫與水通道蛋白密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為感染、炎癥等多屬溫?zé)岵》懂牎7螢閶膳K,為五臟之華蓋,病邪入侵,常先傷肺,邪毒壅肺,肺失宣降,氣不布津,又致病理產(chǎn)物內(nèi)聚,機(jī)體炎癥反應(yīng)加重,病變由肺而累及全身,這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識(shí)甚為相似。中藥或復(fù)方常常是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑、多機(jī)制發(fā)揮作用,對(duì)于綜合調(diào)控復(fù)雜的炎癥反應(yīng)更具優(yōu)勢(shì)[3]。
AQPs是對(duì)水有特異性轉(zhuǎn)運(yùn)功能的細(xì)胞膜通道蛋白,人類和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有10個(gè)亞型,分布在肺、腎、眼部。其中已知在肺組織和氣道至少有 4 種 AQPs (AQP1、AQP3、AQP4、AQP5)表達(dá)并參與肺液體轉(zhuǎn)運(yùn),其中,與肺損傷關(guān)系最密切的研究主要以AQP5和AQP1為主。
AQP1主要在氣道周圍毛細(xì)血管、淋巴管及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和臟層胸膜間皮細(xì)胞上表達(dá),主要負(fù)責(zé)清除支氣管和脈管周圍組織的內(nèi)水分[4]。AQP5主要表達(dá)在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞及氣道分泌上皮頂質(zhì)膜,作用主要是清除肺泡腔內(nèi)水分[5]。AQP1、AQP5特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)水分子,其他溶質(zhì)和分子則不能通過,有效維持血管與間質(zhì)之間水平衡[4]。與野生型小鼠相比,AQP1或AQP5基因敲除小鼠肺泡毛細(xì)血管間水的滲透性、通透性均降低約10倍。AQP1和AQP5均敲除小鼠肺泡毛細(xì)血管間水的滲透性、通透性降低約25~30倍左右[6-7]。AQPs在各種原因形成的肺損傷肺水腫中起重要作用。腺病毒感染小鼠毒造成病毒性肺炎,肺水明顯增加,在病毒感染后7d和14d分別檢測(cè)AQP1和AQP5,發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)量均有顯著降低,但在14天時(shí)AQP1的表達(dá)有所回升,同時(shí)與炎癥反應(yīng)減輕相一致,提示AQPs的減少可能是肺水在肺間質(zhì)聚集的重要原因,表明AQPs可能在病毒感染后的肺水腫中起主要作用[8]。譚利平[9]研究發(fā)現(xiàn),與空氣對(duì)照組相比,高氧暴露不同時(shí)間后,AQP5特異性表達(dá)部位保持不變,但隨暴露時(shí)間延長,AQP5表達(dá)呈逐漸減弱趨勢(shì),推測(cè)高氧肺損傷時(shí)AQP5表達(dá)降低,可能是高氧肺損傷肺水腫形成的原因之一。ALI/ARDS病理過程中,AQP1、5表達(dá)下調(diào),肺泡-毛細(xì)血管間水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,導(dǎo)致液體在肺泡腔、肺間質(zhì)的積聚,從而使肺泡腔、肺間質(zhì)水腫加重,可能參與了肺水腫時(shí)液體的異常轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)肺損傷后AQP1、5在調(diào)節(jié)肺內(nèi)液體平衡中起一定作用,可能參與了肺水腫的發(fā)病機(jī)制[10]。高巨[11]首次觀察到失血性休克和內(nèi)毒素刺激下大鼠肺組織AQP5的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),肺組織損傷嚴(yán)重,提示二次打擊后機(jī)體清除肺間質(zhì)和肺泡腔過多水分的能力明顯減弱,肺泡-毛細(xì)血管膜水通透性顯著降低。與此相對(duì)應(yīng),二次打擊后該組的肺組織含水量也明顯增加。
本實(shí)驗(yàn)中,模型對(duì)照組大鼠w/d值較空白對(duì)照明顯增大,出現(xiàn)肺間質(zhì)水腫同時(shí)AQP1表達(dá)明顯下調(diào),經(jīng)清氣化痰湯治療后,大鼠肺損傷肺水腫改善,同時(shí)AQP1表達(dá)上調(diào)。炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)與AQP1表達(dá)結(jié)果相反。實(shí)驗(yàn)證明肺水腫吸收障礙可能有與AQP1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。清氣化痰湯可通過增加肺毛細(xì)血管和淋巴管AQP1的表達(dá),提高肺間質(zhì)水腫液的跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)運(yùn),促使水從肺間質(zhì)回流到血管系統(tǒng),進(jìn)而促進(jìn)肺水腫的吸收,可達(dá)到治療ALI的目的。本研究發(fā)現(xiàn)清氣化痰湯上調(diào)AQP1的表達(dá),可能是通過下調(diào)TNF-α、IL-1β等表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
[1] 韓恩昆,吳咸中.大承氣湯和活血清胰湯對(duì)重型急性胰腺炎肺損傷治療的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2004,10(2):90-92.
[2] 張雪梅,陳海龍,王朝暉.清胰湯對(duì)大鼠急性胰腺炎肺損傷時(shí)-表達(dá)的影響[J].世界華人消化雜志,2007,15(35):3738-3743.
[3] 劉建新,余林中.中藥保護(hù)急性肺損傷作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,11(6):83-85.
[4] SongYL,YangBX,Michael AM,etal.Roleofayuaporin water channels in pleural fluid dynamics[J].Am JPhysioLCell Physiol,2000,279:1744-1750.
[5] King LS,Agre P.Pathophysiology of theaquaporin water channels [J].Ann Rev Physiol,1997,58(5):619-648.
[6] Song Y,Ma T,Matthav M A,et al.Role of aquaporin-4 in airspaceto-capillary water permeability in intact mouse lung measured by a novel gravimetric method[J].JGen Physiol,2000,115(1):17-27
[7] Ma T,F(xiàn)ukuda N,Song Y,et al.Lung fluid transport in aquaporin-5 knockout mice[J].JClin Invest,2000,105(1):93-100.
[8] Towne J E,Harrod K S,Krane C M,et al.Decreased expression of aquaporin(AQP)1 and AQP5 in mouselungafter acuteviral infection[J].Am JRespir Cell Mol Biol,2000,22(1):34.
[9] 譚利平.水通道蛋白5在高氧肺損傷中的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2006,18(8):462-465.
[10]謝艷萍.急性肺損傷大鼠肺水通道蛋白1和5的表達(dá)及功能的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2005,28(6):385-400.
[11]高巨.“失血性休克-內(nèi)毒素”二次打擊所致肺損傷水通道蛋白的表達(dá)[J].中國急救醫(yī)學(xué),2007,27(6):546-548.