黃俊杰 王彩冰 黃麗娟 趙善民 何顯教 黃彥峰 梁祚仁 李倩茗 黃巨恩

過量飲酒及酗酒對(duì)人類健康的危害正成為日益嚴(yán)重的社會(huì)問題，長期大量飲酒可導(dǎo)致人各種器官的損傷，以肝、腦受損最為嚴(yán)重[1]。由于目前沒有找到治療酒精中毒所致腦損傷的有效藥物，因而預(yù)防酒精中毒對(duì)腦的損傷極為重要。bFGF具有多種生物活性，對(duì)組織創(chuàng)傷具有修復(fù)作用[2]。本研究采用白酒灌胃建立慢性酒精中毒大鼠模型，觀察給予bFGF治療后檢測大鼠腦組織Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-M g2+-ATP酶活力，探討bFGF對(duì)慢性酒精中毒所致的腦損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物慢性酒精中毒模型及與分組

取成年清潔級(jí)W istar雄性大鼠40只，體質(zhì)量250g左右，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（桂）2009-0003）。慢性酒精中毒模型[3-4]大鼠（30只）每日按10g/（kg·d）白酒，分2次灌胃（間隔12h），連續(xù)白酒灌胃60d后，大鼠毛發(fā)無光澤，性情不穩(wěn)定，輕者煩躁不安，精神萎靡、反應(yīng)淡漠、食欲減退和行動(dòng)遲緩，重者出現(xiàn)流涎、體態(tài)呆板、嗜睡，睡眠時(shí)間明顯增多，活動(dòng)明顯減少，進(jìn)食量少于正常對(duì)照組，體重增長緩慢，證明慢性酒精中毒模型成功建立。正常對(duì)照組大鼠毛發(fā)有光澤，體態(tài)活潑，食量及大便正常，無嗜睡現(xiàn)象。慢性酒精中毒模型建立成功的動(dòng)物隨機(jī)抽簽法分為酒精中毒對(duì)照組、NS對(duì)照組和bFGF治療組，每組10只。bFGF治療組大鼠白酒灌胃的同時(shí)，1h后按12g/kg劑量肌肉注射，1次/d，共14d，bFGF由廣州暨南大學(xué)生物工程研究所提供；NS對(duì)照組大鼠白酒灌胃的同時(shí)，1h后肌肉注射與bFGF治療組相同容量的生理鹽水，1次/d，共14d；酒精中毒對(duì)照組只白酒灌胃，不作任何干預(yù)。另外10只大鼠不灌白酒，灌服與白酒同體積的生理鹽水作為正常對(duì)照組。各組動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境、條件均相同：分籠普通飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。室溫26℃，濕度50%～60%飼養(yǎng)。各組大鼠到相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)分別迅速取出腦組織，用生理鹽水洗去表面殘血，準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比加9倍生理鹽水制成10%的腦組織勻漿，1500r/ m in離心10m in后取其上清液，再用生理鹽水將上清液稀釋成2%腦組織勻漿待測定。

1.2 腦組織Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-M g2+-ATP酶活力的測定

Na+-K+-ATP酶活力及Ca2+-M g2+-ATP酶活力的測定試劑盒說明書操作，測定儀器為UV 755B紫外分光度計(jì)（上海分析儀器總廠）。規(guī)定每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活力單位，即（μmolPi/mgprot/ hour）。腦勻漿蛋白定量按采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

bFGF對(duì)慢性酒精中毒大鼠腦組織Na+-K+-ATPase活力和Ca2+-Mg2+-ATPase活力的影響。酒精中毒組與正常對(duì)照組相比，腦組織Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-M g2+-ATP酶活力均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；NS對(duì)照組與酒精中毒組相比，腦組織Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-M g2+-ATP酶活力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；bFGF治療組與酒精中毒組和NS對(duì)照組相比，腦組織Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 b FGF對(duì)酒精中毒大鼠腦組織Na+-K+-ATPase活力和Ca2+-M g2+-ATPase活力的影響±s，n=10）

表1 b FGF對(duì)酒精中毒大鼠腦組織Na+-K+-ATPase活力和Ca2+-M g2+-ATPase活力的影響±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；bFGF治療組與酒精中毒組和正常對(duì)照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別Na+-K+-ATPase活力 Ca2+-M g2+-ATPase活力（μmolPi/mgprot/hour） （μm olPi/mgprot/hour）正常對(duì)照組 0.92±0.11 1.05±0.15酒精中毒組 0.63±0.13** 0.71±0.12** NS對(duì)照組 0.69±0.12 0.59±0.13 bFGF治療組 0.86±0.09▲▲ 0.85±0.17▲

3 討論

過量飲酒對(duì)機(jī)體健康的危害已受到廣泛關(guān)注，長期大量飲酒可導(dǎo)致人各種器官的損傷，乙醇作為一種親神經(jīng)性毒性物質(zhì)，對(duì)中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)均可造成損傷，因此酒精對(duì)腦的損傷最為嚴(yán)重之一[5]。乙醇代謝產(chǎn)生氧自由基增多、細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)是造成線粒體損傷的主要原因：線粒體既是內(nèi)源性氧自由基產(chǎn)生的部位又是氧自由基作用的靶點(diǎn)，腦組織代謝旺盛[6-7]，耗氧量大，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧自由基尤為敏感，若線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p會(huì)進(jìn)一步增加活性氧的生成并形成惡性循環(huán)，同時(shí)酒精代謝產(chǎn)生的外源性氧自由基耗竭細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽，同時(shí)線粒體DNA接近內(nèi)源性氧自由基發(fā)源地，因此更易受到損傷，以上因素均可導(dǎo)致線粒體膜損傷和通透性的改變而誘發(fā)細(xì)胞損傷。

ATP酶是存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器生物膜上的一種蛋白酶，其在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞以及維持細(xì)胞膜的完整、組織代謝等方面具有重要的意義，可作為代謝紊亂及損傷組織恢復(fù)能力的可靠指標(biāo)。ATP酶是逆離子梯度進(jìn)行細(xì)胞膜內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)的離子泵，其中重要的為Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶[8-9]。而作為神經(jīng)營養(yǎng)因子之一的bFGF，具有多種生物活性，可促進(jìn)神經(jīng)元的存活及突起生長，對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用[9-11]。在正常組織與細(xì)胞中，bFGF主要分布于腦、肝、腎、骨、軟骨等組織，bFGF的受體廣泛分布于神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中，其中尤以神經(jīng)元中含量最為豐富。bFGF與其受體結(jié)合，能產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增生分化和血管生成，修復(fù)損傷組織。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，慢性酒精中毒后大鼠腦組織的Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-M g2+-ATP酶活力均明顯高低于正常對(duì)照組，說明慢性酒精中毒后使大鼠腦細(xì)胞發(fā)生損傷。經(jīng)過用bFGF治療酒精中毒大鼠后腦組織的Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均明顯升高，提示bFGF對(duì)慢性酒精中毒所致的腦損傷具有保護(hù)作用。

[1]Hines IN,Wheeler MD.Recent advances in alcoholic liver disease：Role of the innate immune response in alcoholic hepatitis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2004,287（2）：310-314.

[2]Peluso JJ.Basic fibroblast growth factor regulation of the plasma membrane calcium ATPaseas part of an anti-apoptotic mechanism of action[J].Biochem Pharmacol 2003；66（8）：1363-1369.

[3]李一欣,丁鏘.大鼠慢性酒精中毒模型的建立及病理學(xué)觀察[J].山東醫(yī)藥,2008,48（32）：42-43.

[4]古賽,蔣小黎,何琳,等.大鼠慢性酒精性脂肪肝模型的建立[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,31（1）：81-84.

[5]Fakoya FA,Caxton-Martins EA.Neocortical neurodegeneration in young adult Wistar rats prenatally exposed to ethanol[J].Neurotoxicol Teratol,2006,28（2）：229-237.

[6]Heaton MB,Meugf K,Poiud A,et al.Effects of ethanol on neurotrophic factors,apoptosis-related proteins,endogenousan-tioxidants and reactive oxygen species in neonatal stria-tum[J].Brain Res Dev,2003,140（2）：237-243.

[7]徐杰,李成海,陳婉蓉,等.乙醇對(duì)大鼠肝細(xì)胞和腦神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,2004,18（4）：294-296.

[8]文玉杰,李曉玫.鈉鉀ATP酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能新進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2005,36（2）：159-162.

[9]Barber D,Hunt J,Ehrich M.Inhibition of calcium-stimulated ATPase in the hen brain P2 synaptosomal fraction by organophosphorus esters：relevance to delayed neuropathy[J].J Toxicol Environ Health A,2001,63（2）：101-113.

[10]Kim MS，Kim CJ,Jung HS,et al.Fibroblast growth factor-2 induces differentiation and apoptosis of Askin tumour cells[J].J Pathol,2004,202（1）：103-112.

[11]Mizia-Malarz A,Sobol G,Wo H.Proangiogenic factors：vascularendothelial growth factor（VEGF）and basic fibroblast growth factor--the characteristics and function[J].Przeglad lekarski,2008,65（7-8）：353-357.