何少林 李大主 黎 明 馬旭明 林 靜 昌 薇 趙 卉

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430022）

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抗原提呈功能的影響及機(jī)制①

何少林 李大主 黎 明 馬旭明 林 靜 昌 薇 趙 卉

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430022）

目的:探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抗原提呈功能的影響及機(jī)制。方法:磁性細(xì)胞分離器（MACS）分離CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25-T細(xì)胞。在ox-LDL作用下,HUVECs與CD4+CD25+T細(xì)胞共培養(yǎng),24小時(shí)后收集HUVECs。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HUVECs抗原提呈分子（HLADR,CD86,CD80）的表達(dá),Cell Counting Kit-8法（CCK-8）測(cè)定HUVECs刺激CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的能力,Transwell小室實(shí)驗(yàn)初步探討Treg作用于HUVECs的具體機(jī)制。結(jié)果:與對(duì)照組比較,Treg可顯著抑制HUVECs抗原提呈分子的表達(dá)及刺激T細(xì)胞增殖的能力。用Transwell隔離后,與or-LDL刺激組比較,HUVECs抗原提呈分子表達(dá)及其刺激T細(xì)胞增殖的能力無明顯變化。結(jié)論:Treg可顯著抑制HUVECs抗原提呈能力,其作用機(jī)制可能為下調(diào)CD86的表達(dá),且依賴細(xì)胞直接接觸。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系;氧化型低密度脂蛋白;抗原提呈分子;細(xì)胞增殖;Transwell

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種炎癥性疾病[1]。內(nèi)皮損傷及由此介導(dǎo)的T細(xì)胞的活化,歸巢與AS有關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抗原提呈作用,參與諸多炎性疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。Treg可抑制AS,但具體機(jī)制不清[3]。我們既往研究表明Treg可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥分泌功能,此作用可能部分與Treg抑制了內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CD86有關(guān)[4]。但其是否抑制內(nèi)皮細(xì)胞抗原提呈功能及具體機(jī)制尚無報(bào)道。本文探討Treg對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抗原提呈功能的影響和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑DMEM/F-12培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco-BRL公司,按說明書配制,4℃保存;特級(jí)胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物制品公司,使用前56℃水浴30分鐘滅活補(bǔ)體后分裝,-20℃保存;ox-LDL購(gòu)于Sigma公司;DMSO購(gòu)于上海華美生物工程公司;人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所 ;FITC-anti human CD4、PE-anti human CD25、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞免疫磁珠（MACS）分選試劑盒購(gòu)于德國(guó)Miltenyi Biotec公司;human HLA DR-PE 、human CD80-PE 、human CD86-PE、human IgGPE、human anti-CD3 mAb OKT3購(gòu)于美國(guó) eBioscience公司;CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)公司;DNA探針由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.2.1.1 HUVECs的培養(yǎng)及鑒定 取新生兒臍帶,PBS洗凈臍靜脈腔后灌注0.1%Ⅰ型膠原酶,血管鉗夾閉靜脈兩端,置 37℃水浴箱 12～15分鐘,收集消化液,1 200 r/min離心10分鐘,棄上清,加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基,置37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)24小時(shí),PBS洗去紅細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞,加入含10%特級(jí)胎牛血清及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物（100mg/L）的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),2～3天換一次液。至貼壁細(xì)胞70%～80%融合時(shí),用 0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3～5代用于試驗(yàn)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞呈單層鵝卵石樣排列,Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色陽(yáng)性,確定為內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.1.2 CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25-T細(xì)胞的分離及激活 以無菌注射器采集外周50ml（來自健康志愿者）,肝素抗凝,密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）,收集的PBMC用CD4+CD25+Treg細(xì)胞免疫磁珠（MACS）分選試劑盒,陰性選擇獲得CD4+T細(xì)胞;加入PE標(biāo)記抗小鼠CD25單克隆抗體,再加入磁珠標(biāo)記抗PE,陽(yáng)性選擇獲得CD4+CD25+T細(xì)胞,陰性選擇獲得CD4+CD25-T細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur）分析細(xì)胞純度,經(jīng)鑒定其純度分別＞92%和＞98%。將分選后的CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞分別用無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞至終濃度109cells/L,種入預(yù)先包被好human anti-CD3mAb OKT3（10 mg/L）的96孔板,每孔終體積100μl,孵育48小時(shí)。

1.2.2 Treg與HUVECs的共培養(yǎng)及分組 CD4+CD25+T細(xì)胞（均為5×105細(xì)胞/孔）與抗人CD3 mAb（10mg/L）孵育48小時(shí)后,加入種有融合已達(dá)90%的內(nèi)皮細(xì)胞（3×106～4×106細(xì)胞/孔）的培養(yǎng)板中,在終濃度均為50mg/L的ox-LDL中共培養(yǎng)24小時(shí),分為3組:（1）HUVECs組（control組）:HUVECs,不加任何刺激;（2）HUVECs+ox-LDL組（no T組）:HUVECs+ox-LDL;（3）HUVECs+ox-LDL+Treg組（CD25+組）:HUVECs+Treg+ox-LDL。細(xì)胞置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后,移去培養(yǎng)液,用 PBS輕洗2遍,去除未粘附細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶液消化收集HUVECs備用。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVECs HLA DR,CD80,CD86的表達(dá) 收集上述處理過的各組單個(gè)HUVECs,離心棄上清,80μl PBS液重懸,每管加入單克隆抗體human HLA DR-PE或CD86-PE或CD80-PE各20μl,4℃孵育30分鐘,加入含2%BSA,0.1%NaN3的PBS液,1 200 r/min離心,10分鐘,反復(fù)洗2次。去上清,加入1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）500μl,流式細(xì)胞儀檢測(cè),其結(jié)果以陽(yáng)性百分率表示。每份樣本均設(shè)陰性對(duì)照（加相應(yīng)IgG抗體）,以消除本底熒光的影響。

1.2.4 單相淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) CCK-8試劑可簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的測(cè)定細(xì)胞增殖。CD4+CD25+T細(xì)胞與抗人CD3mAbs（10mg/L）孵育48小時(shí),離心重懸。將已被抗人CD3mAbs激活的不同濃度CD4+CD25+T細(xì)胞（HUVECs:Treg 分別為 :0∶1、1∶0、1∶1、1∶0.5、1∶0.25、1∶0.125,分別加入已種有 HUVECs（5×105細(xì)胞/孔）及終濃度均為50mg/L的ox-LDL的培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng),24小時(shí)后胰蛋白酶液消化收集HUVECs,經(jīng)6 000 rad輻照滅活,加入96孔U型板（Nunc）100μl/孔,設(shè)3個(gè)復(fù)孔,過夜培養(yǎng)使其貼壁,次日每孔吸出上清50μl,然后補(bǔ)加等體積的營(yíng)養(yǎng)液,最后加100μl的CD4+CD25-T 細(xì)胞置于 37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)5天。每個(gè)孔內(nèi)加入10μlCCK-8,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)后,酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) Tanswell上下小室間的通透膜孔徑為0.4μm,可允許細(xì)胞因子自由通過,而Treg不能自由通過。實(shí)驗(yàn)分為4組:①HUVECs組（control組）:HUVECs,不加任何刺激;②ox-LDL誘導(dǎo)組（no T組）:HUVECs+50mg/Lox-LDL;③CD4+CD25+T細(xì)胞組（CD25+組）:HUVECs+CD4+CD25+T細(xì)胞+anti-CD3mAbs+50mg/L ox-LDL;④Transwell實(shí)驗(yàn)組（TW組）:下室中種入HUVECs,上室中種入CD4+CD25+T細(xì)胞+anti-CD3mAbs。48小時(shí)后,移走上室,下室中加入50mg/L ox-LDL。各組細(xì)胞均置5%CO2、37℃孵箱,培養(yǎng)24小時(shí)后收獲HUVECs測(cè)定CD86的表達(dá)或行單相淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以上各組實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)三次,結(jié)果均用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間數(shù)據(jù)處理根據(jù)方差齊性分析的結(jié)果,進(jìn)一步使用S-N-K檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的比較,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL 對(duì)HUVECs 表面HLA DR、CD80、CD86表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)表明:與control組比,no T組CD86及HLA DR均顯著升高（P＜0.001）,而CD80表達(dá)無顯著差異（P＞0.05,圖1）。

圖1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)HUVECs表面HLA DR,CD80,CD86表達(dá)的影響Fig.1 Tregmodu lateexp ression of CD80,CD86 and HLA DR in HUVECs impaired by ox-LDL

圖2 單相淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)Fig.2 The effect of Treg treated HUVECs on the p roliferation of CD4+CD25-T cells

2.2 Treg對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs表面HLA DR、CD80、CD86表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)表明:與no T組比,CD25+組CD86表達(dá)顯著下降（P＜0.01）,而HLA DR顯著升高（P＜0.001）,CD80表達(dá)無顯著差異（P＞0.05,圖1）。

2.3 單相淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 與HUVECs∶Treg為 0∶1 時(shí)比 ,HUVECs∶Treg 為 1∶0 時(shí)HUVECs刺激CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的能力顯著升高（P＜0.001）。而與HUVECs∶Treg為 1∶0時(shí)比,當(dāng)加入的Treg逐漸升高時(shí),HUVECs刺激CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的能力逐漸下降（所有P＜0.05,圖2）。

2.4 Treg對(duì)HUVECs的抑制作用依賴于細(xì)胞直接接觸和細(xì)胞因子

2.4.1 與no T組相比,CD25+組HUVECs CD86表達(dá)下降（P＜0.001）,但TW組HUVECs CD86無明顯變化（P＞0.05）,表明Treg對(duì)HUVECs CD86表達(dá)的抑制作用可被Transwell小室逆轉(zhuǎn)（圖3A和B）。

2.4.2 與no T組相比,CD25+組HUVECs刺激T細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.001）,但TW組HUVECs刺激T細(xì)胞增殖能力無明顯變化（P＞0.05）,表明Treg對(duì)HUVECs刺激T細(xì)胞增殖能力的抑制作用可被Transwell小室逆轉(zhuǎn)（圖3C）。

圖3 Treg對(duì)HUVECs的抑制作用依賴于細(xì)胞直接接觸和細(xì)胞因子Fig.3 Tregmediated supp ression of HUVECs antigen-presenting function requires cell

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種炎癥性疾病,免疫反應(yīng)促進(jìn)了AS病變進(jìn)展[1]。傳統(tǒng)的AS危險(xiǎn)因素如ox-LDL能刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)各種炎性因子,吸引炎性細(xì)胞并使其在局部粘附,進(jìn)而進(jìn)入內(nèi)膜下,產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[5]。在這一進(jìn)程中,作為兼職抗原提呈細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞被炎性介質(zhì)激活,并表達(dá)MHC-Ⅱ和共刺激分子提呈抗原,從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng),為關(guān)鍵步驟之一[6,7]。有報(bào)道認(rèn)為抗原提呈細(xì)胞（APC）的抗原力與其表面分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表達(dá)量呈正相關(guān)。此外,CD86組成性地低表達(dá)于未受刺激的APC,APC活化后,CD86分子的表達(dá)先于CD80迅速上調(diào);轉(zhuǎn)染CD80的腫瘤細(xì)胞,其免疫原性明顯低于轉(zhuǎn)染CD86的腫瘤細(xì)胞,因而認(rèn)為CD86是啟動(dòng)免疫應(yīng)答更重要的分子[8,9]。但既往研究存在爭(zhēng)議,有報(bào)道認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)CD80和/或CD86[10],有報(bào)道認(rèn)為不表達(dá)[11]。這種差異一般認(rèn)為與細(xì)胞來源,細(xì)胞所處代數(shù)或不同的培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中,在ox-LDL刺激下,HUVECs可高表達(dá)HLA DR與CD86,而CD80在刺激前后均為低表達(dá),提示在ox-LDL刺激下,HUVECs具有非常強(qiáng)的抗原提呈能力,且主要依賴于HLA DR與CD86。

他人及我們的諸多研究表明,Treg在AS炎癥反應(yīng)的調(diào)控中起重要作用:AS病人循環(huán)中Treg的數(shù)量和功能下調(diào)[12];過繼輸入Treg可以抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[13];Treg可抑制ox-LDL致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子如VCAM-1、MCP-1及IL-6的表達(dá),且此過程中我們發(fā)現(xiàn)Treg可抑制內(nèi)皮細(xì)胞CD86的表達(dá)[4]。但Treg是否可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的抗原提呈能力及可能機(jī)制,研究較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HUVECs與Treg共培養(yǎng)24小時(shí),HUVECs CD86表達(dá)顯著被抑制,與我們既往研究相似[4]。HUVECs與不同濃度Treg共培養(yǎng)后,其刺激CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的能力亦顯著被抑制,說明Treg可下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的抗原提呈能力,抑制其介導(dǎo)的免疫反應(yīng),從而發(fā)揮抗AS的作用。

Treg發(fā)生免疫調(diào)節(jié)的確切機(jī)制尚存爭(zhēng)議,有的報(bào)道認(rèn)為其調(diào)節(jié)功能依賴于細(xì)胞直接接觸;也有報(bào)道認(rèn)為其調(diào)節(jié)功能由細(xì)胞因子介導(dǎo)[14]。產(chǎn)生這一差異的原因可能與Treg作用于不同的細(xì)胞,或與其發(fā)揮不同的效應(yīng)時(shí)所依賴的機(jī)制不同有關(guān)。如本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Treg與HUVECs共培養(yǎng)后HUVECs CD86的表達(dá)及其刺激T細(xì)胞增殖能力明顯下降;而用Transwell小室阻斷Treg與HUVECs直接接觸后,上述效應(yīng)被完全逆轉(zhuǎn),說明Treg對(duì)HUVECs抗原提呈能力的抑制作用依賴于細(xì)胞直接接觸。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)表明Treg作為一種內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)者,可抑制ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVECs抗原提呈分子的表達(dá)及刺激T細(xì)胞增殖的能力,從而抑制AS的發(fā)生發(fā)展。上述發(fā)現(xiàn)不僅有助于闡明Treg在AS發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用,而且為AS的防治提供了一條新的途徑。

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[收稿2010-11-27 修回2011-01-13]

（編輯 許四平）

CD4+CD25+regulatory T cellsmodulate antigen-p resenting function of human umbilical vein endothelial cells

HEShao-Lin,LIDa-Zhu,LIMing,MAXu-Ming,LINJing,CHANGWei,ZHAOHui.InstituteofCardiology,Union Hospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

Objective:To investigate whether and how Treg affect the antigen-presenting function of HUVECs,and themechanism of Treg in the developmentof atherosclerosis.Methods:Treg were isolated from human peripheral b loodmononuclear cells（PBMCs）which obtained from normal volunteers bymagnetic cell sorting-column and analyzed by Flow Cytometry.HUVECswere incubated alone（control）or with anti-CD3mAbs activated Treg（CD25+）and ox-LDL.After 24 h,HUVECswere collected and the expression of HLA DR,CD80 and CD86 weremeasured by flow cytometry.ox-LDL treated HUVECs which were pre-cultured with different concentrations of human anti-CD3 mAbs activated Treg were used to stimu late CD4+CD25-T cells,and then the effectof HUVECs on the proliferation of CD4+CD25-T cells weredetected by Cell Counting Kit-8（CCK-8）.Transwell experimentwasused to identify how Treg affect the antigen-presenting function of HUVECs.Results:Treg can significantly inhibit the expression ofantigen presentingmolecular in HUVECs aswellas theeffectof HUVECs on the proliferation of CD4+CD25-T cellswhen compared with that in control system;Mechanistic studies reveal that the expression of antigen p resentingmolecular in HUVECs and theeffectof HUVCs on the proliferation of CD4+CD25-T cells in TW system haveno differencewhen compared with that in no Tsystem.Conclusion:Treg areable tomodulate the antigen-presenting function ofHUVECs,which is largely attributed to a down-regulated expression in CD86 in Treg-treated HUVECs and depended on cell contact.

CD4+CD25+Regulatory T cells;Human umbilical vein endothelial cells;oxidized Low-Density Lipoprotein;Antigen-presentingmolecules;Cell proliferation

R392.12

A

1000-484X（2011）05-0391-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.002

①本文為國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目（No.30670855）

何少林（1983年-）,男,博士,主要從事冠心病發(fā)病機(jī)理及其診斷與治療研究,E-mail:wskg1982@yahoo.com.cn;

及指導(dǎo)教師:李大主（1963年-）,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事冠心病發(fā)病機(jī)理及其診斷與治療研究,E-mail:lidazhuhp@sohu.com。