首都醫(yī)科大學(xué)數(shù)學(xué)教研室(100069) 華 琳 鄭衛(wèi)英 張金旺 劉 紅 閆 巖

同胞對(duì)連鎖分析的三種統(tǒng)計(jì)方法比較*

首都醫(yī)科大學(xué)數(shù)學(xué)教研室(100069) 華 琳 鄭衛(wèi)英 張金旺 劉 紅△閆 巖

*：北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM200910025006)

△通訊作者：劉紅

在很多物種中，無(wú)論是低等的酵母，還是高等的人類(lèi)，許多基因的表達(dá)水平都展示出豐富的自然變異。而目前，很多科研工作都集中于研究疾病發(fā)展不同階段的基因表達(dá)水平，較少研究健康人群基因表達(dá)的自然變化。事實(shí)上，健康人群個(gè)體間的遺傳變異常常和人類(lèi)復(fù)雜疾病的易感性及復(fù)雜疾病性狀有密切聯(lián)系。而人類(lèi)基因組中廣泛存在并被廣泛應(yīng)用的第三代基因遺傳標(biāo)記，即SNP標(biāo)記，是一種能夠穩(wěn)定遺傳的早期突變，研究者可以通過(guò)對(duì)SNP的相關(guān)分析和高密度的SNP圖譜來(lái)定位一系列復(fù)雜疾病的相關(guān)基因。

我們通過(guò)分析健康人群淋巴母細(xì)胞基因表達(dá)的自然變化，發(fā)現(xiàn)可能存在影響基因表達(dá)的標(biāo)記位點(diǎn)，從而提示這些標(biāo)記位點(diǎn)可能對(duì)遺傳、進(jìn)化及復(fù)雜疾病的易感性有重要的生物學(xué)意義。我們利用三種統(tǒng)計(jì)分析方法，逐步判別分析、逐步logistic回歸和同胞對(duì)Haseman-Elston回歸，將Centre d'Etude du Polymorphisme Humain(CEPH)家族淋巴母細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和SNP基因型數(shù)據(jù)結(jié)合在一起。我們將1號(hào)染色體上的HSPA6的基因表達(dá)水平作為數(shù)量性狀，利用同胞對(duì)的H-E(Haseman-Elston)線性回歸方法對(duì)50個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行連鎖定位，同時(shí)對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行重新設(shè)置，使之成為分類(lèi)變量，分別采用逐步判別分析、逐步logistic回歸分析方法作連鎖分析，從而發(fā)現(xiàn)影響HSPA6表達(dá)水平的SNP遺傳標(biāo)記。我們采用matlab 6.5編寫(xiě)程序?qū)崿F(xiàn)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，采用著名數(shù)量遺傳學(xué)家Dr.Robert C.Elston和他的研究小組開(kāi)發(fā)的遺傳流行病學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng) SAGE 5.2的 SIBPAL〔1〕模塊實(shí)現(xiàn)Haseman-Elston回歸。采用SAS軟件實(shí)現(xiàn)逐步判別分析、廣義可加模型和逐步logistic回歸。

方 法

1.Haseman-Elston線性回歸〔2〕

同胞對(duì)的Haseman-Elston線性回歸法是根據(jù)同胞對(duì)間的表型差異與同胞對(duì)共享來(lái)自同一祖先的標(biāo)記等位基因IBD(identity-by-descent)個(gè)數(shù)平均值估計(jì)的關(guān)系模型進(jìn)行連鎖定位的。

設(shè)一個(gè)家系中s個(gè)同胞的第j對(duì)同胞的HSPA6表達(dá)值為x1j，x2j，同胞對(duì)的基因表達(dá)差異：

其中 β0為截距，βi和 di(i=1，2，…，m)分別為 m 個(gè)遺傳標(biāo)記中第i個(gè)標(biāo)記的加性和顯性遺傳方差，(i=1，2，…，m)分別為第 i個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)上同胞對(duì)共享IBD個(gè)數(shù)平均值估計(jì)值和同胞對(duì)共享兩個(gè)等位基因的概率估計(jì)值，ck是反應(yīng)協(xié)變量yk的函數(shù)f(yk)對(duì)表達(dá)值的影響系數(shù)，e為隨機(jī)誤差。

當(dāng)只考慮一個(gè)標(biāo)記時(shí)，模型則退化為

我們采用單標(biāo)記回歸法(即模型2)，分別對(duì)CEPH 家族的4 個(gè)家系(1333，1340，1341，1345)54 個(gè)個(gè)體1號(hào)染色體的50個(gè)SNP標(biāo)記作連鎖分析，估計(jì)回歸參數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)假設(shè)為：H0：θ=(無(wú)連鎖);H1：θ＜(存在連鎖)，若 P ＜0.05，則可判斷這一SNP標(biāo)記與HSPA6的基因表達(dá)水平存在連鎖。

2.逐步判別分析

逐步判別分析是在每一步選一個(gè)判別能力最強(qiáng)的指標(biāo)變量進(jìn)入判別函數(shù)，直至判別函數(shù)中所有指標(biāo)的判別能力都有意義，而判別函數(shù)外的所有指標(biāo)都不能納入。

設(shè)有m個(gè)指標(biāo)變量，分別用x1，x2，…，xm來(lái)表示，有G個(gè)類(lèi)別。具體步驟為：

(1)計(jì)算總離差陣 T，類(lèi)內(nèi)離差陣 W，T-1，W-1，行列式|T|，|W|及 Wilks統(tǒng)計(jì)量

其中U越小，判別能力越強(qiáng)。

(2)逐步剔除無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)變量

假設(shè)有p個(gè)指標(biāo)變量已被選入判別函數(shù)。對(duì)于未入選的m-p個(gè)指標(biāo)變量中的任何一個(gè)指標(biāo)變量xr，我們將W和T矩陣分解為

若 F ＞Fα(G-1，N-p-G)，則認(rèn)為第 r個(gè)指標(biāo)變量的判別能力有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

我們將1號(hào)染色體上的HSPA6基因的表達(dá)水平計(jì)算均值。重新設(shè)置表達(dá)變量，如果個(gè)體的表達(dá)值大于均值，設(shè)為1，小于均值設(shè)為0。對(duì)98對(duì)同胞對(duì)作分析，如果同胞對(duì)的兩個(gè)個(gè)體表達(dá)變量均為0，我們作為G1類(lèi);如果兩個(gè)體表達(dá)變量一個(gè)為0，一個(gè)為1，我們作為G2類(lèi);如果兩個(gè)個(gè)體表達(dá)變量均為1，則作為G3類(lèi)。用每個(gè)SNP標(biāo)記的IBD值作為指標(biāo)變量。

3.逐步logistic回歸

將98對(duì)同胞對(duì)中每個(gè)同胞對(duì)的HSPA6基因表達(dá)水平作差并取絕對(duì)值，即

將d'作為分類(lèi)變量，將50個(gè)SNP標(biāo)記的IBD作為協(xié)變量，作逐步logistic回歸分析。

數(shù)據(jù)處理與數(shù)值分析

首先采用Matlab 6.5軟件編寫(xiě)程序?qū)⒈磉_(dá)譜數(shù)據(jù)和SNP基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為SAGE5.2可識(shí)別的輸入文件。由于SIBPAL模塊需要有Geneibd文件，所以應(yīng)先通過(guò)Geneibd模塊產(chǎn)生Geneibd文件。產(chǎn)生Geneibd文件需要有四個(gè)輸入文件，即家系資料文件、參數(shù)文件、等位基因位置文件和由Freq模塊生成的等位基因頻率文件。將生成的Geneibd數(shù)據(jù)文件通過(guò)我們編寫(xiě)的程序輸入到SAS程序中，分別作逐步判別分析和逐步logistic回歸分析。我們將四種統(tǒng)計(jì)分析方法的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1中可以看出逐步判別分析識(shí)別出6個(gè)SNP標(biāo)記，逐步logistic回歸識(shí)別出3個(gè)SNP標(biāo)記，Haseman-Elston線性回歸識(shí)別出2個(gè)SNP標(biāo)記。從連鎖分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，顯然逐步判別分析要優(yōu)于其他方法，逐步logistic回歸和Haseman-Elston線性回歸的效果相似。三種方法均發(fā)現(xiàn)SNP標(biāo)記位點(diǎn)rs5556161和rs991191有意義，提示這兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)附近可能存在影響HSPA6基因表達(dá)水平的性狀位點(diǎn)?；騂SPA6位于1號(hào)染色體(chr1q23)，將此基因映射到 GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)，在生物學(xué)過(guò)程中分別為GO：6457((protein folding)和 GO：6986(response to unfolded protein)，說(shuō)明該基因與蛋白質(zhì)的展開(kāi)折疊相關(guān)。分子功能為 GO：166(nucleotide binding)和 GO：5524(ATP binding)，說(shuō)明該基因的分子功能是核酸結(jié)合與ATP結(jié)合。SNP rs5556161和SNP rs991191可能影響該基因的表達(dá)水平，從而影響基因功能。

表1 三種統(tǒng)計(jì)方法的連鎖分析結(jié)果比較(98對(duì)同胞對(duì))

另一方面，我們可以通過(guò)看逐步判別分析過(guò)程中F統(tǒng)計(jì)量的變化來(lái)分析基因間的交互作用〔4〕(表2)。

表2 逐步判別分析中6個(gè)SNP標(biāo)記的F統(tǒng)計(jì)量變化

從表 2中，我們可以觀察到，在第二步中，rs5556161的F值從6.10下降到0.50，而 rs1511687的F值從2.86上升到8.92，說(shuō)明 rs991191可能與rs5556161和rs1511687存在交互作用。同樣，在第三步中，rs5556161的 F值從 0.50上升到 7.40，rs1511687的F值從8.92下降到2.74，rs2209698的F值從0.02上升到3.68，說(shuō)明這三個(gè)SNP位點(diǎn)均可能與rs1924761存在交互作用。

討 論

本文采用了三種統(tǒng)計(jì)分析方法作同胞對(duì)的連鎖分析。它們同時(shí)均發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNP位點(diǎn)rs5556161和rs991191有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明這兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)附近可能存在影響HSPA6基因表達(dá)水平的性狀位點(diǎn)。但比較而言，逐步判別分析要優(yōu)于其他兩種方法。本文采用的數(shù)據(jù)是健康人群淋巴母細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。而在實(shí)際應(yīng)用中，這三種方法均可用于復(fù)雜疾病的連鎖分析。由于同胞對(duì)Haseman-Elston回歸要求性狀為數(shù)量性狀，而很多復(fù)雜疾病的數(shù)量性狀常常很難表達(dá)，逐步判別分析和逐步logistic回歸分析恰好可以將復(fù)雜性狀用分類(lèi)變量表示，進(jìn)而再作連鎖分析。因此，對(duì)于數(shù)量性狀位點(diǎn)QTL或表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)eQTL，適用于采用H-E回歸進(jìn)行連鎖分析。而對(duì)于狀態(tài)變量(疾病或正常)，可選擇采用逐步logistic回歸和逐步判別分析方法。逐步判別分析和逐步logistic回歸有很多類(lèi)似的地方。但是，如果研究的位點(diǎn)較多(如全基因組的連鎖分析)，會(huì)使得logistic回歸中變量大量增加，從而導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確性，應(yīng)進(jìn)行多重校正。相比較而言，逐步判別分析在分析較多位點(diǎn)時(shí)，統(tǒng)計(jì)效能要高些。另一方面，如果我們想分析位點(diǎn)或基因的交互作用，通過(guò)逐步判別分析中SNP標(biāo)記的F統(tǒng)計(jì)量變化，就可以初步發(fā)現(xiàn)這種交互作用，當(dāng)然這種交互作用還需要大樣本的數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證。而且，逐步判別分析法還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是不需要預(yù)先了解基因表達(dá)值和各個(gè)SNP標(biāo)記之間的關(guān)系，因此它不會(huì)象一般的線性回歸那樣對(duì)模型要求很高〔5〕?？傊琒NP數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)挖掘技術(shù)作為一種新的連鎖分析方法必將會(huì)在復(fù)雜疾病的連鎖分析中起著重要作用。

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