張志亮，張玉林（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，衛(wèi)輝市 453100；.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng)市 453000）

骨舒湯對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎中血清NO和血液流變學(xué)的影響

張志亮1＊，張玉林2（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，衛(wèi)輝市 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng)市 453000）

目的：研究骨舒湯對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎中血清一氧化氮（NO）和血液流變學(xué)的影響。方法：隨機(jī)選擇健康大耳白兔72只均分成6組，即空白（10m L生理鹽水）、模型（10m L生理鹽水）、壯骨關(guān)節(jié)丸（10m L，濃度：0.7 g·m L-1）和骨舒湯高、中、低劑量（20、10、5 m L，濃度：0.7 g·m L-1）組。采用改良的Hulth法復(fù)制模型。ig給藥，每天1次，連續(xù)8周。觀察兔血清、軟骨NO含量和血液流變學(xué)指標(biāo)，電鏡下觀察兔膝關(guān)節(jié)切片。結(jié)果：模型組兔血清、軟骨NO含量及血液流變學(xué)指標(biāo)顯著高于空白組（P＜0.05）。骨舒湯高劑量組兔血清、軟骨NO含量及血液流變學(xué)指標(biāo)均較模型組顯著下降（P＜0.05）。切片可見(jiàn)，模型組兔骨切片可見(jiàn)壞死軟骨細(xì)胞，排列紊亂，潮線不完整；骨舒湯高劑量組兔關(guān)節(jié)軟骨面光滑、軟骨細(xì)胞柱狀排列，潮線完整。結(jié)論：高劑量骨舒湯可降低模型兔膝骨性關(guān)節(jié)炎血清和軟骨中NO含量，同時(shí)降低血液流變學(xué)指標(biāo)，調(diào)節(jié)血液功能，從而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。

骨舒湯；骨性關(guān)節(jié)炎；血清一氧化氮；血液流變學(xué)

世界衛(wèi)生組織（WHO）流行病學(xué)調(diào)查顯示骨性關(guān)節(jié)炎是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的致殘性肌骨骼源性疾病，但骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。骨舒湯是當(dāng)前治療骨性關(guān)節(jié)炎的有效經(jīng)驗(yàn)方，具有良好的效果[2]。本研究設(shè)計(jì)通過(guò)對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中NO含量的測(cè)定，研究骨舒湯治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效機(jī)制，希望為臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DK-8A型電熱恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KDC-40型低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；723型分光光度機(jī)（上海光譜儀器有限公司）；LIANG-100血液比黏度計(jì)（香港興萬(wàn)電子儀器（廈門(mén)）有限公司）。

1.2 試藥

熟地、桑寄生、獨(dú)活、杜仲、牛膝、當(dāng)歸、川芎、甘草（河南中信藥材有限公司提供），經(jīng)筆者鑒定為真品；壯骨關(guān)節(jié)丸（華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：20100601）；戊巴比妥鈉（河南宏達(dá)醫(yī)學(xué)儀器有限公司，批號(hào)：57-33-0）；大鼠一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動(dòng)物

72只實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)大耳白兔，體重（2.4±0.062）kg，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2010-0013）。將兔分籠飼養(yǎng)，自由飲用自來(lái)水，溫度、濕度為普通級(jí)條件，飼料由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 模型復(fù)制

以雙側(cè)卵巢切除法復(fù)制骨質(zhì)疏松模型。兔稱(chēng)重，3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液0.4m L·100 g-1ip行全身麻醉。將兔取仰臥位，固定四肢、頭部于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。取兔下腹部正中，沿腹白線縱向切口2～3 cm，切開(kāi)皮膚、皮下組織，鈍性分離肌肉，打開(kāi)腹腔，找到雙側(cè)卵巢并提起后用手術(shù)線將其周?chē)噙B血管及輸卵管結(jié)扎，然后切除左右卵巢，用3號(hào)手術(shù)線縫合切口，75%酒精消毒切口。

2.2 分組和給藥

實(shí)驗(yàn)分為6組，即空白（10m L生理鹽水）、模型（10m L生理鹽水）、壯骨關(guān)節(jié)丸（10m L，濃度：0.7 g·m L-1）和骨舒湯高、中、低劑量（20、10、5m L，濃度：0.7 g·m L-1）組。模型復(fù)制1周后ig給藥，每天1次，連續(xù)8周。骨舒湯組成：熟地20 g、桑寄生20 g、獨(dú)活15 g、杜仲15 g、牛膝15 g、當(dāng)歸10 g、川芎10 g、甘草5 g，藥材混合后煎煮70m in，取濾液，貯藏，備用。

2.3 NO水平測(cè)定

末次ig給藥24 h后，兔耳緣靜脈取血2m L，血液凝固后分離血清，將血清置于－20℃貯藏，待檢?？諝馑ㄈ幩浪型茫杆偾虚_(kāi)左后肢關(guān)節(jié)，用銳利刀片切取膝關(guān)節(jié)前正中的部分滑膜組織，切取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，10%甲醛溶液固定，標(biāo)本用0.1moL·L-1二甲砷酸鈉緩沖液漂洗24 h后，用乙二胺四乙酸二鈉溶液脫鈣。脫鈣后用石蠟包埋、切片機(jī)連續(xù)橫向切片，厚度61μm，HE染色后光鏡觀察。采用硝酸還原酶法測(cè)定NO含量，測(cè)定原理根據(jù)NO半衰期短僅數(shù)秒，遇氧或水生成硝酸鹽，硝酸鹽與磺胺及萘乙二胺反應(yīng)生成粉紅色偶氮化合物，通過(guò)比色可間接測(cè)定NO含量。同時(shí)觀察血液學(xué)指標(biāo)ig給藥后變化：ig給藥后抽取大耳兔腹靜脈血4～5m L，用肝素抗凝搖勻后立即送檢。應(yīng)用血液比黏度計(jì)進(jìn)行全血比黏度及血漿比黏度測(cè)定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 NO含量的測(cè)定

與空白組比較，模型組兔血清及軟骨NO含量顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，骨舒湯高、中、低劑量組兔血清及軟骨NO含量顯著下降（P＜0.05）。血清及關(guān)節(jié)軟骨中NO含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血清及關(guān)節(jié)軟骨中NO含量測(cè)定結(jié)果（±s）Tab 1 Contentof NO in the serum and cartilage（±s）

表1 血清及關(guān)節(jié)軟骨中NO含量測(cè)定結(jié)果（±s）Tab 1 Contentof NO in the serum and cartilage（±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

組別空白組模型組壯骨關(guān)節(jié)丸組骨舒湯低劑量組骨舒湯中劑量組骨舒湯高劑量組軟骨32.75±0.41 59.28±0.62＊55.71±0.11 53.87±0.81# 52.47±0.64# 51.23±0.16# n 12 12 12 12 12 12 NO含量/nmol·L-1血清23.42±0.56 39.45±0.20＊36.72±0.20 36.52±0.51# 35.92±0.45# 35.1±0.31#

3.2 切片觀察

骨舒湯高劑量組兔關(guān)節(jié)軟骨面較光滑，由淺入深可分為表淺層、移行層、放射層和鈣化層，各層間清晰可辨，軟骨細(xì)胞呈柱狀排列，潮線較完整；模型組關(guān)節(jié)軟骨表層軟骨變薄、粗糙，部分區(qū)域呈絨毛狀，可見(jiàn)較多裂隙從表層軟骨延伸向下深達(dá)輻射層，裂隙中可見(jiàn)稀疏的結(jié)締組織及松散的網(wǎng)狀鏈接，裂隙周?chē)梢?jiàn)脫水固縮壞死的軟骨細(xì)胞，靠近表層有較多囊性改變，整個(gè)軟骨細(xì)胞排列紊亂，潮線不完整。兔膝關(guān)節(jié)切片圖見(jiàn)圖1。

3.3 血液流變學(xué)指標(biāo)

與空白組比較，模型組兔血液流變檢查部分指標(biāo)（全血黏度高切、全血黏度低切）顯著提高（P＜0.05）；與模型組比較，骨舒湯高劑量組兔血液流變檢查各項(xiàng)指標(biāo)（全血黏度高切、全血黏度低切、血漿黏度）顯著下降（P＜0.05）。血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 兔膝關(guān)節(jié)切片圖A.骨舒湯高劑量組；B.模型組Fig 1 Slicesof rabbit knee jointA.Gushu decoction high-dosegroup；B.modelgroup

表2 血液流變學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（±s）Tab 2 Determ ination ofhemorheology inde（x±s）

表2 血液流變學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（±s）Tab 2 Determ ination ofhemorheology inde（x±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

組別空白組模型組壯骨關(guān)節(jié)丸組骨舒湯低劑量組骨舒湯中劑量組骨舒湯高劑量組n 12 12 12 12 12 12全血黏度高切/mPa·s-1 4.62±0.63 4.82±0.62＊4.12±0.31 3.50±0.36 3.36±0.56 3.26±0.72#全血黏度低切/mPa·s-1 11.06±1.18 11.39±2.01＊7.78±1.25# 7.90±1.32 7.21±1.23 6.71±1.01#血漿黏度/mPa·s-1 1.99±0.06 2.05±0.04 1.85±0.25 1.81±0.02 1.72±0.03 1.58±0.02#

4 討論

骨性關(guān)節(jié)炎的藥物防治目標(biāo)是借助藥物的抗骨吸收功能以維持骨量和促進(jìn)骨形成的能力從而提高骨質(zhì)量，達(dá)到增強(qiáng)骨強(qiáng)度，超越骨折閾值[3]的目的。NO是一種高度反應(yīng)性、細(xì)胞毒性、彌散性物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌、真菌和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，同時(shí)也對(duì)正常組織產(chǎn)生損傷[4]。NO主要通過(guò)兩種途徑產(chǎn)生組織損傷：（1）高濃度的NO能抑制多種與線粒體電荷傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶，如檸檬酸酶、烏頭酸酶等，通過(guò)與酶的硫鐵中心結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞鐵減少而抑制線粒體呼吸，引起細(xì)胞損傷。（2）NO在溫度37℃時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，遇到酸性條件便迅速分解為有很強(qiáng)毒性的OH-和N-自由基，這兩種自由基具有非常強(qiáng)的氧化性，因而有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，從而造成組織細(xì)胞損傷[5]。

有體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NO在軟骨細(xì)胞凋亡中起重要作用，其他細(xì)胞調(diào)控因子如白介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）、脂多糖（LPS）、氧自由基等均不能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。還有研究用橫切斷前交叉韌帶的方法誘導(dǎo)出兔的膝關(guān)節(jié)炎模型，發(fā)現(xiàn)脛骨遠(yuǎn)端、股骨近端的關(guān)節(jié)軟骨能產(chǎn)生較高含量的NO，有軟骨細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞凋亡數(shù)量隨NO含量而變化。有研究證實(shí)，人類(lèi)關(guān)節(jié)中的軟骨母細(xì)胞在體外培養(yǎng)中并無(wú)NO產(chǎn)生，但只要加入炎性細(xì)胞因子，如IL-1、TNF-β等，這些炎性因子就會(huì)激活軟骨母細(xì)胞中的誘導(dǎo)型NOS而產(chǎn)生大量NO。這些炎性細(xì)胞因子對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用一部分是通過(guò)NO實(shí)現(xiàn)的[6]。

骨舒湯是前人針對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎“本虛標(biāo)實(shí)"的病因病機(jī)而設(shè)的經(jīng)驗(yàn)方，在長(zhǎng)期實(shí)踐中結(jié)合現(xiàn)代藥理研究運(yùn)用本方治療骨性關(guān)節(jié)炎療效顯著，其治以滋補(bǔ)肝腎、益氣養(yǎng)血，輔以祛風(fēng)散寒、活血化瘀、通絡(luò)止痛的治法。本研究表明，采用骨舒湯治療的模型兔血清及軟骨NO含量顯著低于模型組（P＜0.05）；血液流變檢查各項(xiàng)指標(biāo)也顯著低于模型組（P＜0.05）。表明骨舒湯具有較好的鎮(zhèn)痛、抗炎、消腫作用，在細(xì)胞因子的參與刺激下產(chǎn)生大量NO，調(diào)節(jié)血液功能，維持軟骨的形態(tài)和功能的完整性。

綜上，NO含量升高成為關(guān)節(jié)軟骨退變和滑膜炎癥的重要病因之一，骨舒湯能夠有效降低骨質(zhì)疏松模型兔血清、關(guān)節(jié)軟骨中NO水平，同時(shí)可以引起血液流變學(xué)指標(biāo)的下降，調(diào)節(jié)血液功能，從而對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)作用。

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Effects of Gushu Decoction on Serum NO and Hemorheology of Osteoarthritis

ZHANG Zhi-liang（The FirstAffiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Weihui453100，China）
ZHANG Yu-lin（Xinxiang Medical College，Xinxiang 453000，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Gushu decoction on serum NO and hemorheology of osteoarthritis.METHODS：72 Japanese white rabbits were random ly divided into 6 groups：blank group（10 m L normal saline），model group（10 m L normal saline），Zhuanggu guanjie pill group（10 m L，0.7 g·m L-1），Gushu decoction high-dose，medium-dose and low-dose groups（20，10，5 m L，0.7 g·m L-1）.Modified Hulth was used to induce osteoarthritismodel.Model rabbits were given relevantmedicines intragastrically once a day for 8 weeks.The contents of NO in serum and cartilage and hemorheology index were observed，and slices of rabbit jointwere observed under electron microscope.RESULTS：The content of NO in serum and cartilage and hemorheology index in model group were significantly higher than blank group（P＜0.05）.The content of NO in serum and cartilage and hemorheology index in Gushu decoction high-dose group decreased significantly，compared w ith model group（P＜0.05）.The patellar slices of rabbits in model group showed cartilage cells necrosis in disorder arrangement，incomplete tidal line.In Gushu decoction high-dose group，smooth cartilage，columnar arrangement of cartilage cell and complete tidal line were observed.CONCLUSION：Gushu decoction high dose can reduce the content of NO in serum and cartilage and hemorheology index，regulate blood function so as to play a protective effect on articular cartilage.

Gushu decoction；Osteoarthritis；Serum NO；Hemorheology

R285；R97

A

1001-0408（2011）31-2892-03

＊主管中藥師。研究方向：藥物臨床應(yīng)用。E-mail：zyyx2006@ 126.com

2011-01-07

2011-04-09）