胡中倩，汪心怡，儲著朗，鄭賢芳，陳 吉，余科科，李菲菲，瞿成奎，汪思應

（1.安徽醫(yī)科大學病理生理學教研室，合肥 230032；2.美國凱斯西儲大學，克里夫蘭 44106）

SHP-2屬于蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPase）家族成員之一，作為細胞因子、生長因子及其他胞外刺激因素的下游信號分子，表達于機體的各種組織和細胞中，與許多重要的細胞生命活動（如細胞增殖、分化、移動、死亡的調(diào)控）密切相關［1，2］。近年來，SHP-2突變在白血病、實體瘤和努南綜合征中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［3］，是最早被定義為癌基因的酪氨酸磷酸酶。SHP-2突變位點主要位于N端SH2結構域，其中最常見的是E76K和D61G/Y突變，這些激活突變使得N-SH2與PTP結構域的自身結合部分或完全解離，導致SHP-2酪氨酸磷酸酶的活性不同程度增強，故稱激活突變（gain-offunction mutation）。SHP-2激活突變可能與腫瘤尤其是白血病細胞的惡性生物學行為，如高增殖敏感性、耐藥、易侵襲轉移等密切相關。臨床也發(fā)現(xiàn)部分青少年粒細胞性白血病（JMML）患兒（35％患者體內(nèi)存在SHP-2激活突變）發(fā)病早、進展快，多數(shù)患者因白細胞包括白血病細胞大量浸潤導致多器官衰竭而早期死亡［4］。

前期研究［5-7］從細胞和分子水平證實，SHP-2D61G/+激活突變可能通過增強的NF-κB信號途徑促進白細胞黏附、侵襲。本研究以SHP-2D61G/+激活突變敲入的模型小鼠為研究對象，進一步從整體水平觀察SHP-2激活突變對組織白細胞浸潤、細胞因子分泌和多器官損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，新生牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；放射免疫試劑盒由中國原子能科學研究院提供，儀器為FJ-2008型γ免疫計數(shù)器；光學顯微鏡照相系統(tǒng)購于日本Olympus公司。

1.2 實驗動物

SHP-2D61G/+激活突變小鼠由美國Case Western Reserve大學瞿成奎教授提供，模型小鼠表達生理水平的SHP-2D61G蛋白，但磷酸酶活性卻升高2～5倍。野生型小鼠采用C57BL/6小鼠，雌雄各半，16周齡，體重25±0.2 g，SPF級，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供［SCXK（皖）2009-0001］）。

1.3 小鼠白細胞的分離與培養(yǎng)

無菌采取小鼠血1 mL，嚴格按照白細胞分離液說明書操作。細胞培養(yǎng)用含10％滅活新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（含105U/L青霉素，105U/L鏈霉素），在37℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。

1.4 ELISA檢測細胞因子IL-2和TNF-α

設空白孔、標準孔和待測樣品孔（每孔加樣100μL），加入detection antibody工作液50μL，室溫孵育2 h后用wash buffer反復洗滌5次；然后加入streptavidin-HRP工作液100μL，室溫反應30 min后充分洗滌；依次加入color reagent A和color reagent B各50μL，室溫避光顯色30 m in，之后加入stop solution 50μL終止反應；用酶聯(lián)儀在450 nm波長下測量A值。根據(jù)樣品的A450值由標準曲線計算出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即可得到樣品中待檢物質的實際濃度。

1.5 血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）和cTnI水平的檢測

16周齡小鼠，取內(nèi)眥靜脈血，分離血清，按試劑盒說明采用放射免疫法檢測血清中的丙氨酸轉氨酶和肌鈣蛋白I。

1.6 心、肺、脾組織的病理觀察

常規(guī)石蠟切片（厚度6～7μm），采用HE染色，依次進行脫蠟（二甲苯I 10 min，二甲苯II 5 min）、水化（100％酒精I 5 min，100％酒精II 5 min，95％酒精I 5 m in，95％酒精II 5 m in，85％酒精3 min，75％酒精2 m in，蒸餾水沖洗1 min）、染色（蘇木精染色5 min，自來水洗，鹽酸酒精分化15 s，自來水洗15 m in，蒸餾水洗2 m in，75％酒精2 m in，85％酒精2 m in，0.5％伊紅染色1 min，95％酒精I 5 m in，95％酒精II 5 min，100％酒精I 5 min，100％酒精II 5 min，二甲苯I 5 min，二甲苯II 5min）。中性樹膠封片后，光鏡下觀察組織病理變化。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 SHP-2D61G/+激活突變對小鼠組織器官白細胞浸潤的影響

與SHP-2+/+野生型小鼠相比，SHP-2D61G/+激活突變小鼠肺、脾組織中可見大量白細胞浸潤，組織損傷并有淤血、出血表現(xiàn)；心肌組織主要表現(xiàn)為肥大，但光鏡下沒有發(fā)現(xiàn)明顯白細胞浸潤及損傷表現(xiàn)（圖1見彩插3）。

2.2 SHP-2D61G/+激活突變對小鼠白細胞分泌炎癥因子的影響

白細胞浸潤組織后可以分泌細胞因子包括炎癥因子、趨化因子等，本研究首先觀察體外白細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子的水平。與野生型對照組相比，SHP-2D61G/+激活突變小鼠白細胞培養(yǎng)上清中IL-2及TNF-α濃度均顯著增加（P＜0.01），說明SHP-2激活突變使白細胞分泌炎癥因子水平明顯提高（表1）。

表1 SHP-2D61G/+激活突變對白細胞分泌炎癥因子的影響（n=8）Tab.1 Effect of SHP-2D61G/+mutations on leukocyte secretion of inflammatory factors in the mice（n=8）

2.3 SHP-2D61G/+激活突變對小鼠血清炎癥因子水平的影響

本研究進一步在體觀察了血清中上述炎癥因子的水平。與野生型小鼠相比，SHP-2D61G/+激活突變小鼠血清中IL-2和TNF-α濃度均顯著增高（P＜0.01）（表2）。

表2 SHP-2D61G/+激活突變對血清炎癥因子水平的影響（n=8）Tab.2 Effect of SHP-2D61G/+mutations on serum levels of inflammatory factors in the m ice（n=8）

2.4 SHP-2D61G/+激活突變對小鼠血清ALT及cTnI水平的影響

血清ALT及cTnI水平分別是反應肝臟和心臟組織損傷的指標，本實驗采用放射免疫法檢測野生型和SHP-2D61G/+激活突變小鼠血清中ALT及cTn I水平。SHP-2突變小鼠血清中丙氨酸轉氨酶明顯高于對照組（圖2）。盡管組織學檢測在光鏡下沒有發(fā)現(xiàn)心肌明顯損傷，但反應心肌損傷敏感指標之一的肌鈣蛋白I水平在突變小鼠血清中明顯升高（圖3），提示心肌亦有損傷。事實上SHP-2激活突變導致奴南氏綜合征患者也出現(xiàn)心臟肥大和心肌損傷。

圖2 SHP-2D61G/+激活突變對小鼠血清ALT水平的影響（n=12）Fig.2 Effect of SHP-2D61G/+mutations on serum ALT levels in the m ice（n=12）

圖3 SHP-2D61G/+激活突變對小鼠血清cTn I水平的影響（n=12）Fig.3 Effect of SHP-2D61G/+mutations onserum cTnI level in themice（n=12）

3 討論

SHP-2是非受體依賴的酪氨酸磷酸酶，其N端SH-2結構域是一個含有100個氨基酸殘基的基團，與激酶結構域結合，通過分子內(nèi)的相互抑制，使磷酸酶維持在鈍化狀態(tài)而抑制了SHP-2磷酸酶的活性。當SHP-2通過SH-2功能域結合到具有磷酸化的酪氨酸殘基的蛋白質，使PTP酶激活，從而作為下游信號分子參與信號轉導［8，9］。Neel等［10］制備了SHP-2D61G/+突變基因敲入小鼠模型，研究顯示該小鼠經(jīng)DNA損傷性藥物處理后，其白血病發(fā)病明顯高于正常鼠，說明SHP-2D61G/+激活突變可促進白血病發(fā)病。本研究采用已經(jīng)建立的SHP-2D61G/+基因敲入小鼠為研究對象，證實SHP-2D61G/+激活突變促進組織白細胞嚴重浸潤和心、肝、脾、肺等多器官損傷。

細胞因子和炎癥介質的失控性釋放是導致多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要原因。前期研究從細胞和分子水平證實，SHP-2D61G/+激活突變促進白細胞粘附及侵襲能力。本研究不僅在離體實驗中證實SHP-2D61G/+激活突變使白細胞分泌炎癥因子明顯增加，而且體內(nèi)實驗也證實小鼠血清中IL-2和TNF-α水平均顯著升高；這些炎癥因子的增加會進一步促進炎性細胞浸潤，導致器官損傷。

小鼠血清cTn I和ALT水平在SHP-2D61G/+突變小鼠中明顯高于野生型小鼠。cTn I是近年來發(fā)展起來的一種高特異、高靈敏反映心肌損傷的血清標志物，cTn I以兩種形式存在于心肌細胞中，即小部分游離于細胞質內(nèi)，為可溶性；大部分以結構蛋白形式固定于肌原纖維上，為不溶性。當胞膜的完整性因缺血、缺氧受到破壞時，游離的cTnI可迅速透過細胞膜進入血流；而結合的cTn I則逐漸分解出來，成為游離的cTnI。因此，外周血中cTn I濃度增加，必然是心肌細胞損傷的結果。當肝細胞發(fā)生炎癥、壞死、中毒時，造成肝細胞破壞，ALT便會釋放到血液里，使血清ALT升高。通過檢測血液中ALT可以反映肝細胞有無受損［11］。

本實驗對突變小鼠器官進行病理切片、HE染色鏡檢，結果顯示SHP-2D61G/+突變小鼠脾、肺組織可見大量淋巴細胞及漿細胞浸潤、血管內(nèi)皮細胞腫脹、血管內(nèi)淤血和組織損傷，心肌細胞出現(xiàn)肥大。當炎癥細胞過度活化，細胞因子網(wǎng)絡相互作用通過瀑布式級聯(lián)效應，炎癥反應泛濫、失控；而抗炎介質過度表達和釋放可引起免疫功能的抑制，導致機體失衡，最終導致全身組織器官的損傷而發(fā)展為多器官功能障礙綜合征和衰竭［12］。研究進一步對此改變做了初步的分子機制探討，結果顯示SHP-2異常增高的磷酸酶活性是發(fā)生多臟器衰竭的主要原因。上述結果為臨床部分白血病患者易出現(xiàn)多器官功能衰竭的機制研究提供了一定的線索。這是否是SHP-2激活突變小鼠病情惡化的原因，具體機制還有待進一步深入研究。

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