朱 華，劉 穎，李 秦，盧 珊，馮 銘，肖 沖，安沂華，趙春華，王任直，秦 川

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所Motac合作實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京

協(xié)和醫(yī)院，北京 100073；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100005； 5.北京神經(jīng)外科研究所，北京 100050）

動(dòng)物模型是研究缺血性腦卒中損傷機(jī)制、對(duì)神經(jīng)保護(hù)劑療效作出判斷必不可少的工具。嚙齒類動(dòng)物大腦與人的大腦有許多不同，對(duì)于相同缺血損傷的反應(yīng)可能不同。因此，難以明確怎樣將動(dòng)物的給藥方案擴(kuò)大到人體。非人靈長類在種屬關(guān)系上較接近于人，腦血管的解剖學(xué)特點(diǎn)與人類似，更應(yīng)引起研究者注意的是非人靈長類可技巧性的使用四肢完成運(yùn)動(dòng)任務(wù)。利用這些特點(diǎn)制備的靈長類缺血性腦卒中動(dòng)物模型用于評(píng)價(jià)干細(xì)胞等神經(jīng)保護(hù)劑的效果，不僅可以從組織病理學(xué)及影像學(xué)方面，更可通過較系統(tǒng)的行為學(xué)分析評(píng)價(jià)其療效。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性食蟹猴18只［SCXK-（京）2005-005］，購自協(xié)爾鑫生物資源研究所，年齡4～6歲，體重4.2～4.5 kg。

1.2 主要儀器及試劑

精準(zhǔn)上肢測(cè)試系統(tǒng)：透明樹脂板上嵌有食槽，每次訓(xùn)練及采集數(shù)據(jù)時(shí)將該裝置懸掛于猴籠正面。

1.3 腦缺血模型的制作

使用光化學(xué)法制作局部腦缺血模型。具體方法見參考文獻(xiàn)［1］。

1.4 干細(xì)胞移植

1.4.1 動(dòng)物及分組：18只動(dòng)物分為模型對(duì)照組、高劑量組、低劑量組，分組的原則是各組動(dòng)物間體重差異沒有顯著性。各組劑量（表1）。

1.4.2 細(xì)胞注射：細(xì)胞為250μL的無色懸液，5個(gè)移植途徑，每個(gè)移植途徑50μL。進(jìn)針深度9 mm。每次注射完畢留針 1 min。移植速度50μL/min。對(duì)照組注射等體積生理鹽水。注射途徑、速度、進(jìn)針深度與劑量組相同。

1.5 行為學(xué)數(shù)據(jù)采集

1.5.1 前期訓(xùn)練：首先使動(dòng)物消除恐懼心理，誘導(dǎo)動(dòng)物能從實(shí)驗(yàn)者手中抓取水果塊。與動(dòng)物建立感情后，掛上實(shí)驗(yàn)裝置，將水果塊置于食槽中央。逐步引導(dǎo)動(dòng)物從投食處取食。每天上、下午固定時(shí)間各進(jìn)行1次。訓(xùn)練期間每日喂食改為1次，每次30 g，訓(xùn)練結(jié)束后給與。保證飲水。訓(xùn)練期間監(jiān)控動(dòng)物體重，根據(jù)體重調(diào)整喂食量。

表1 動(dòng)物分組Tab.1 Grouping of the animals

1.5.2 數(shù)據(jù)采集：所有動(dòng)物從實(shí)驗(yàn)裝置中取食狀況穩(wěn)定后進(jìn)行本底數(shù)據(jù)采集。方法：將蘋果切成2 cm ×2 cm×2 cm大小，擺放在食槽中央，每次5塊。用秒表記錄動(dòng)物動(dòng)物將5塊水果全部取走的時(shí)間。每次數(shù)據(jù)的采集在1 d內(nèi)完成，共5次，每次間隔2 h。每次采集時(shí)，水果塊的大小、形狀及擺放位置要一致。造模后1 d、3 d、1、2、3、4周及干細(xì)胞注射后1 d、3 d、1、2、3、4、5、6、8周采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，方法及采集時(shí)間與采集本底數(shù)據(jù)時(shí)相同。比較造模前后動(dòng)物受損傷側(cè)上肢抓取水果塊的時(shí)間，評(píng)價(jià)造模效果。比較干細(xì)胞注射前后動(dòng)物受損傷側(cè)上肢抓取水果塊的時(shí)間，評(píng)價(jià)干細(xì)胞的治療效果。

1.5.3 神經(jīng)功能評(píng)分：造模后1 d、3 d、1、2、3、4周及干細(xì)胞注射后1 d、3 d、1、2、3、4、5、6、8周使用經(jīng)過修改、細(xì)化的Kito靈長類動(dòng)物神經(jīng)功能損害評(píng)分表對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，其中意識(shí)28分，感覺系統(tǒng)22分，運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)32分，骨骼肌共濟(jì)協(xié)調(diào)18分共100分［6］。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理：使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用相關(guān)性分析，單因素方差分析，P值小于0.05時(shí)認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 模型制作

18只動(dòng)物在麻醉蘇醒后均出現(xiàn)了與梗死部位相對(duì)應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)定位體征。主要表現(xiàn)為動(dòng)物蘇醒后6 h內(nèi)表現(xiàn)為有意識(shí)但情緒低落，對(duì)疼痛和聲音刺激不反抗。骨骼肌出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)。受損傷側(cè)上肢出現(xiàn)明顯的麻痹，不能抓握。跛行。術(shù)后3 d部分動(dòng)物的抓握能力有所恢復(fù)，但在采集數(shù)據(jù)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，動(dòng)物受損傷側(cè)上肢抓取水果塊的時(shí)間與手術(shù)前差異均存在極顯著性 （P＜0.01）（表2）。神經(jīng)功能評(píng)分在術(shù)后24 h最高，隨后出現(xiàn)漸進(jìn)性恢復(fù)（表3）。

2.2 干細(xì)胞治療

干細(xì)胞治療后1 d，動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)已出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，但與對(duì)照組比較差異無顯著性。從治療后3 d開始到治療后第8周，模型組動(dòng)物與高低劑量組動(dòng)物間在抓取水果塊的時(shí)間上差異均存在顯著性 （P＜0.05）（表4）。神經(jīng)功能評(píng)分在治療2周后差異出現(xiàn)顯著性（P＜0.05）（表5）。高、低劑量組間差異未見顯著性。

表2 手術(shù)前后動(dòng)物抓取水果塊時(shí)間的比較（s；±s；n=18） Tab.2 Comparison of the times at that the animals pick up the food before and after surgery

表2 手術(shù)前后動(dòng)物抓取水果塊時(shí)間的比較（s；±s；n=18） Tab.2 Comparison of the times at that the animals pick up the food before and after surgery

Note：＊＊P＜0.01，手術(shù)前，B.S：before surgery；手術(shù)后，A.S：after surgery.

時(shí)間Time術(shù)前B.S術(shù)后24 h 24 hrs A.S術(shù)后3 d 3 d A.S術(shù)后1周1 wk A.S術(shù)后2周2 wks A.S術(shù)后3周3 wks A.S術(shù)后4周4 wks A.S左手upper left hand 13.4±1.82 150.9±16.27＊＊105.1±10.73＊＊ 87.5±8.96＊＊ 64.9±17.09＊＊ 58.1±12.82＊＊ 48.4±8.40＊＊

表3 手術(shù)前后神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果 n=18Tab.3 Comparison of neurological deficit scores before and after surgery

表4 干細(xì)胞治療前后動(dòng)物抓取水果塊時(shí)間的比較（s；±s；n=6） Tab.4 Comparison of the times at that the animals pick up the food before and after stem cell transplantation

表4 干細(xì)胞治療前后動(dòng)物抓取水果塊時(shí)間的比較（s；±s；n=6） Tab.4 Comparison of the times at that the animals pick up the food before and after stem cell transplantation

Note：*P＜0.05，手術(shù)前，B.S：before surgery；手術(shù)后，A.S：after surgery；A.T：after stem cell transplantation.

組別Group時(shí)間Time術(shù)前B.S術(shù)后24 h 24 h A.S術(shù)后4周4 wks A.S移植1天1 d A.T移植3天3 ds A.T移植1周1 wk A.T模型組Control 12.4±2.71 160.3±9.19 50.6±9.65 46.8±11.56 44.3±15.75 48.2±13.72高劑量組High dose 14.0±6.90 155.5±20.37 47.0±6.45 34.4±17.17 18.6±2.98* 17.7±6.18*低劑量組Low dose 13.3±1.97 140.7±24.34 49.3±10.64 32.4±12.89 23.4±8.32* 21.9±5.59*組別Group時(shí)間Time移植2周2 wks A.T移植3周3 wks A.T移植4周4 wks A.T移植5周5 wks A.T移植6周6 wks A.T移植8周8 wks A.T模型組Control 42.1±17.48 46.5±7.49 41.5±2.69 49.0±3.39 46.6±14.99 46.5±15.98高劑量組High dose 19.1±5.86* 27.8±16.94* 25.3±14.61* 27.1±15.40* 22.2±6.93* 22.8±6.35*低劑量組Low dose 23.6±6.12* 22.2±1.60* 15.7±1.81* 20.8±0.72* 18.7±1.94* 20.0±5.90*

表5 干細(xì)胞治療前后神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果（n=6） Tab.5 Comparison of neurological deficit scores before and after stem cell transplantation

3 討論

對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血損傷后的行為做出評(píng)價(jià)是與人類卒中后臨床表現(xiàn)特點(diǎn)緊密相關(guān)的。1999年在美國福羅里達(dá)州召開的STAIR卒中會(huì)議制訂了六條評(píng)價(jià)腦卒中新藥的標(biāo)準(zhǔn)，其中第四條強(qiáng)調(diào)了神經(jīng)功能測(cè)評(píng)的重要性。目前在對(duì)神經(jīng)保護(hù)劑的療效進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，研究者們的注意力大多放在缺血后的病理改變上。但早在1986年，Bothe等就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了“隱蔽損傷”現(xiàn)象［2］，即缺血損傷后有時(shí)盡管組織病理表現(xiàn)是接近正常甚至是正常的，但已存在功能異常。此時(shí)，以缺血面積或細(xì)胞的喪失程度做為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)顯然是不可靠的。因而缺血損傷后行為學(xué)檢查所顯示的功能異常成為確定神經(jīng)元早期死亡的唯一手段。

目前用于非人靈長類的神經(jīng)行為評(píng)價(jià)方法主要有兩種：量表法和通過完成任務(wù)來測(cè)試動(dòng)物腦缺血損傷后的運(yùn)動(dòng)損害、認(rèn)知障礙、肢體力量及精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能等。專門為猴卒中設(shè)計(jì)的量表包括卒中臨床等級(jí)評(píng)價(jià)量表［3］、標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)評(píng)定量表［4，5］、猴栓塞后神經(jīng)缺陷評(píng)價(jià)量表等［6］，其中的猴栓塞后神經(jīng)缺陷評(píng)價(jià)量表即我們采用的kito量表。這個(gè)量表專門針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷而設(shè)計(jì)，與臨床卒中病人采用的量表類似。通過完成任務(wù)來測(cè)試非人靈長類神經(jīng)功能的方法主要有：抓取食物丸任務(wù)［7，8］，主要用于評(píng)價(jià)手的靈巧度；山和谷階梯任務(wù)［9］，主要用于鑒別運(yùn)動(dòng)損害與視覺空間缺陷。精細(xì)運(yùn)動(dòng)測(cè)試主要用于評(píng)價(jià)肢體力量和精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能，符合本實(shí)驗(yàn)的要求。因此采用這種測(cè)試方法評(píng)價(jià)模型動(dòng)物的神經(jīng)功能。

用量表對(duì)靈長類的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)的優(yōu)點(diǎn)是比較直觀，可分系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，不需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練。但要求評(píng)價(jià)者有較豐富的經(jīng)驗(yàn)，不同的人對(duì)同一動(dòng)物進(jìn)行評(píng)價(jià)其結(jié)果可能相差較多。精細(xì)上肢運(yùn)動(dòng)測(cè)試方法在實(shí)驗(yàn)正式開始前需要花費(fèi)大量時(shí)間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練，動(dòng)物一旦掌握了抓取食物的方法，即可通過時(shí)間上的差異對(duì)動(dòng)物手術(shù)前后及注射干細(xì)胞后的療效進(jìn)行比較客觀的評(píng)價(jià)。

我們對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的精細(xì)上肢運(yùn)動(dòng)測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行了改造，使測(cè)試板配有樹脂玻璃限制，只有被評(píng)價(jià)的上肢能接近，通過記錄動(dòng)物取出全部水果塊的時(shí)間可提供關(guān)于肢體力量、精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能方面的全部信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，食蟹猴光化學(xué)法造模后出現(xiàn)了明顯的行為學(xué)癥狀。隨著時(shí)間推移癥狀有所減輕，2周左右神經(jīng)功能評(píng)分和精細(xì)上肢運(yùn)動(dòng)測(cè)試都達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。表明模型建立方法是穩(wěn)定可靠的。劑量組行為學(xué)在注射干細(xì)胞后3 d開始改善。神經(jīng)功能評(píng)分和精細(xì)上肢運(yùn)動(dòng)測(cè)試分別在注射后2周和1周出現(xiàn)顯著性差異。在今后的實(shí)驗(yàn)中，可通過2名有經(jīng)驗(yàn)的人員分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，取二者平均值的方法減少量表評(píng)價(jià)法的主觀性。

綜上所述，上肢精準(zhǔn)測(cè)試系統(tǒng)雖然在實(shí)驗(yàn)前需要做較多的準(zhǔn)備工作，但因其能客觀準(zhǔn)確的反應(yīng)動(dòng)物神經(jīng)功能，結(jié)合神經(jīng)功能評(píng)分，在非人靈長類腦卒中動(dòng)物模型建立和藥效學(xué)評(píng)價(jià)方面有廣泛的應(yīng)用前景。

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