李 巍，石巧娟，郭紅剛，樓 琦，盧領(lǐng)群，薩曉嬰

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江省實驗動物中心，杭州 310013）

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無過量飲酒史，以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪蓄積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合癥，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化。近年來，隨著人類生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，NAFLD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且發(fā)病呈低齡化。然而，由于NAFLD病因復(fù)雜，確切致病機理至今仍尚未形成定論，對NAFLD的預(yù)防、診斷、治療策略也很有限。有關(guān)脂肪肝的病因?qū)W、預(yù)防和治療的研究具有極其重要的意義，并已經(jīng)成為研究熱點。越來越多的證據(jù)表明，部分NAFLD并不是一種良性的、靜止的病變，它可在較短期內(nèi)發(fā)展為不可逆的肝損害，其肝纖維化的發(fā)生率高達(dá)25％，其中約1.5～8.0％的患者可進一步發(fā)展為肝硬化［1，2］。研究非酒精脂肪肝發(fā)展過程是澄清脂肪肝發(fā)病機理，開發(fā)藥物和發(fā)展針對性預(yù)防和治療方案的關(guān)鍵所在。

動物模型是研究人類疾病的重要手段，現(xiàn)有的單純高質(zhì)飲食誘導(dǎo)的NAFLD動物模型與人類疾病的病因、病機及病程發(fā)展都存在一定的差別，對模型動物在不同的造模時間所處的組織病理及相關(guān)生理生化變化鮮有報道。脂肪肝被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)形式，而長爪沙鼠是研究代謝綜合征比較理想的實驗動物，目前已建立了長爪沙鼠高膽固醇血癥、Ⅱ型糖尿病模型及肥胖等代謝綜合征模型［3-6］。長爪沙鼠的脂代謝有許多特點與人類脂代謝相似［7，8］，同時由于其個體小，易于實驗的管理和操作，是一個良好的研究脂代謝方面的動物。本研究以單純高脂飲食建立沙鼠NAFLD模型，通過動態(tài)分析肝臟病理變化，檢測同時期肝組織游離脂肪酸含量、脂質(zhì)代謝、肝功能、抗氧化等指標(biāo)，探討沙鼠NAFLD形成及發(fā)展的機理，為研究NAFLD的發(fā)病發(fā)展機制和治療靶點選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：蛋黃粉為浙江省長興縣艾格生物制品有限公司產(chǎn)品。膽固醇、三號膽鹽購于華東醫(yī)藥股份有限公司。食用豬油購于超市。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（GOT）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-c）和低密度脂蛋白（LDL-c）診斷試劑盒均購自上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司?？偟鞍锥繙y試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-PX）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒和游離脂肪酸（FFA）測試盒均購自南京建成生物工程研究所，并由南京建成生物工程研究所完成盲樣檢測。

1.1.2 實驗儀器：意大利Autolab全自動生化分析儀PM4000，日本Olympus生物顯微鏡SZX7、美國Media Cybernetics公司多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)，德國萊卡切片機，低溫高速臺式離心機TGLY6G。

1.1.3 實驗動物：（50±10）g雄性長爪沙鼠120只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2008-0034；使用許可證號：SYXK（浙）2008-0114）。

1.1.4 飼料配方：普通飼料及高脂飼料由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心加工生產(chǎn)。高脂飼料配方為：普通飼料80.5％、蛋黃粉10％、豬油7％、膽固醇2％、三號膽鹽0.5％［9-12］。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為對照組與模型組，每組60只。對照組給予普通飼料作為陰性對照，模型組給予高脂飼料建立NAFLD模型。于對比飼養(yǎng)第1、2、4、6、8、16周末，隨機抽選模型組與對照組各10只沙鼠，進行標(biāo)本采集及相應(yīng)的指標(biāo)測定。

1.2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)測定：動物稱重后用1％戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血方式致死。分離血清，測定CHO、TG、HDL-c、LDL-c、GOT及GPT的含量。取肝臟稱重，以臟器重量/體重×100％計算臟器指數(shù)。將取自肝最大葉中部組織用4％甲醛固定并制備石蠟切片，進行HE染色和Mallory三色染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。另切0.5g肝右葉，勻漿后，測定SOD、GSH-px、CAT、FFA的含量。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法：計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件分析。各組間比較采用兩樣本均數(shù)的T檢驗。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理學(xué)分析

2.1.1 外觀特征：對照組沙鼠肝臟均柔潤，暗紅色，有光澤（圖1 A）。模型組（圖1 B～G）隨飼喂時間延長，肝臟色澤逐漸由暗紅變成赭色（2周）、土褐色（6周）和奶黃色（16周）；肝臟邊緣由尖銳逐漸變?yōu)閳A鈍，包膜越來越緊張，腫脹程度逐步加劇。這表明，模型組沙鼠脂肪肝程度隨時間加劇。

圖1 隨高脂飼喂時間的延長沙鼠的肝臟外觀變化（圖中由A到G依次為對照組，1，2，4，6，8，16周）Fig.1 Gross appearance of the livers at different time points（A to G：control，1，2，4，6，8，16 weeks）

2.1.2 光鏡觀察：HE染色和Mallory三色染色顯示，對照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，小葉結(jié)構(gòu)及匯管區(qū)均未見異常，細(xì)胞完整（圖2）。模型組1、2、4、6、8、16周所有動物肝組織均出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性，而且，NAFLD進展程度與高脂飲食時間正相關(guān)。具體來講，1周時肝組織約10％～30％的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性（圖3），肝索結(jié)構(gòu)尚存；2周約30％～40％肝細(xì)胞脂肪變性，肝索結(jié)構(gòu)排列紊亂（圖4），形成單純性脂肪肝模型；4周時約40％～60％肝細(xì)胞脂肪變性，模型動物單純性脂肪肝進一步加劇（圖5）；6周時60％～80％肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞排列混亂，部分動物門管區(qū)有炎癥（圖6），形成脂肪性肝炎模型；8周肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)疏松淡染，肝細(xì)胞內(nèi)充滿細(xì)小泡沫樣脂滴空泡，腺泡Ⅲ帶局灶性竇周/細(xì)胞周纖維化（圖7）；16周時，75％～90％肝細(xì)胞脂肪變性，腺泡Ⅲ帶肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一、形態(tài)各異的脂滴空泡，（圖8），局灶性或廣泛的中度橋接纖維化（圖9），形成脂肪性肝纖維化模型（圖2～9見彩插2）。

2.2 肝功能及肝指數(shù)指標(biāo)分析

由圖10可知，1周末，模型組沙鼠肝指數(shù)已高于對照組（P＜0.05），在1～16周模型組沙鼠肝指數(shù)表現(xiàn)出進行性增長趨勢，16周時模型組肝指數(shù)達(dá)到對照組的2倍以上。由表1可知8周末，GOT、GPT出現(xiàn)了升高但無顯著性；16周末，GOT、GPT出現(xiàn)了顯著性升高（P＜0.01）。數(shù)據(jù)說明，8周末開始模型組動物出現(xiàn)肝細(xì)胞破損。

圖10 沙鼠肝指數(shù)的變化（n=10）Fig.10 Changes of liver index of the gerbils（n=10）

表1 沙鼠血清GOP及GTP肝指數(shù)的變化Tab.1 Changes of serum GOT and GPT levels and liver indexes of the gerbils（n=10）

表2 沙鼠血清CHO、TG、LDL-C和HDL-C的變化Tab.2 Changes of serum CHO，TG，LDL-C，HDL-C levels of the gerbils（n=10）

2.3 血脂分析（CHO、TG、LDL-C、HDL-C）

由表2可知，與同期對照組相比，模型組沙鼠1周末血清CHO、TG、LDL-C、HDL-C均已有顯著性升高（P＜0.05，P＜0.01），6周時血脂水平有所回落；除TG外，其余三項在8周時均有所回升，持續(xù)升高到16周末。此數(shù)據(jù)表明沙鼠在不同階段出現(xiàn)了不同程度的血脂紊亂。模型組沙鼠HDL-C雖有顯著性升高，但各階段HDL-C/CHO比值均低于對照組，表明沙鼠血漿中的膽固醇轉(zhuǎn)運與人類相同，即更多的依賴于低密度脂蛋白。

2.4 肝游離脂肪酸含量分析

由表3可知，與同期對照組相比，模型組1周后肝組織FFA含量即出現(xiàn)了顯著升高（P＜0.01），6周時有所回落，8周時回升持續(xù)升高到16周末。表明了沙鼠在高脂飲食1周后肝內(nèi)即有過量的FFA堆積。

表3 沙鼠肝組織FFA含量的變化Tab.3 Changes of FFA content in liver tissue of the gerbils（n=10）

2.5 抗氧化相關(guān)酶類活性分析

由表4可知，1-4周末模型組CAT活性有顯著性降低（P＜0.01）；8-16周末GSH-px活性有顯著性降低（P＜0.01）；4、16周末SOD活性有降低（P＜0.01），但未出現(xiàn)持續(xù)性的變化。16周末，抗氧化酶活性（SOD、GHS-PX、CAT）活性都顯著性降低（P＜0.01），GSH-px、CAT活性為對照組酶活性的1/2。不同抗氧化酶在不同時期表現(xiàn)出的顯著性降低可能與沙鼠NAFLD模型病情的發(fā)展相關(guān)。

3 討論

人類疾病動物模型是醫(yī)學(xué)研究中建立的具有人類疾病表現(xiàn)的動物模型。人類疾病的發(fā)生發(fā)展是十分復(fù)雜的，應(yīng)用人類疾病動物模型，可克服復(fù)雜因素，并增加方法學(xué)上的可比性，有利于更全面地認(rèn)識疾病的本質(zhì)。人類疾病動物模型的設(shè)計應(yīng)遵循相似性、重復(fù)性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經(jīng)濟性等原則，已有的NAFLD動物模型尚無法滿足上述的設(shè)計原則。目前，NAFLD模型可以分為先天性/誘導(dǎo)遺傳突變遺傳性脂肪肝和通過理化因素處理而產(chǎn)生的獲得性脂肪肝兩大類。相比而言，高脂飲食法可克服其他方法存在的或費用昂貴，或材料耗費多、穩(wěn)定性差、成功率欠高、對動物損傷過重或死亡率過高等弊端，最重要的是高脂飲食法更符合人類膳食習(xí)慣與自然發(fā)病規(guī)律。高脂飲食法NAFLD動物模型最常用的實驗動物為大鼠，但該模型造模時間較長，TG血癥難以出現(xiàn)或不穩(wěn)定。臨床上NAFLD隨病情的進展可表現(xiàn)為單純性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化4個階段，而大鼠NAFLD模型停滯在脂肪性肝炎模型階段，進一步發(fā)展為肝纖維化模型則需要輔以酒精［13，14］，與人類NAFLD病程不符。目前尚缺乏滿足人類疾病動物模型設(shè)計原則的NAFLD動物模型。本研究以長爪沙鼠為實驗動物復(fù)制人類NAFLD模型。該模型除滿足重復(fù)性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經(jīng)濟性等人類疾病動物模型的設(shè)計原則外，最大的優(yōu)點在于該模型發(fā)病條件及病程進展表現(xiàn)出與人類NAFLD的相似性，在以符合人類膳食習(xí)慣與自然發(fā)病規(guī)律相似的單純性高質(zhì)飲食條件的誘導(dǎo)下，2周后形成穩(wěn)定的脂肪肝模型，隨著飼喂時間的延長，脂質(zhì)蓄積不斷加劇，中期出現(xiàn)炎癥灶，中后期發(fā)展為脂肪性肝纖維化（部分動物肝臟出現(xiàn)硬化），彌補了其他實驗動物無法以單純的高脂飲食法復(fù)制肝纖維化模型的缺陷。

表4 沙鼠肝組織SOD，GSH-PX，CAT活性的變化Tab.4 Changes of SOD，GSH-PX and CAT enzyme activity in liver tissue of the gerbils（n=10）

綜合沙鼠NAFLD模型在不同的造模時間所處的肝臟病理變化及肝組織游離脂肪酸含量、脂質(zhì)代謝、肝功能、抗氧化等指標(biāo)的結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂與氧化應(yīng)激在沙鼠NAFLD模型病程進展中的發(fā)揮了不同的作用。流行病學(xué)顯示，高脂血癥為脂肪肝的重要危險因素，關(guān)系最為密切的為高TG血癥。而過量的游離脂肪酸（外源性或內(nèi)源性），特別是不飽和FFA，在肝內(nèi)積聚是NASH的發(fā)病激發(fā)因素［15］。飼喂高脂飼料1周后，沙鼠出現(xiàn)了持續(xù)的血脂升高，肝組織FFA含量顯著性增加，推測這些變化都與肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。另一方面，肝內(nèi)FFA水平的升高為也為活性氧的大量產(chǎn)生提供了來源?，F(xiàn)代研究表明，活性氧增多和活性氧清除劑減少是NASH的重要發(fā)病機制［16］。機體活性氧清除劑主要包括超氧化物歧化酶（SOD）等酶類和谷胱甘肽（GSH）等非酶類活性氧清除劑?；钚匝踉龆嗪突钚匝跚宄齽p少引起氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激是引起單純的脂肪變性向脂肪性肝炎和肝硬化進展的主要原因［17］。推測由于模型組沙鼠肝內(nèi)FFA水平持續(xù)升高導(dǎo)致大量活性氧的生成，CAT、SOD、GSH-PX酶活性在不同階段內(nèi)的顯著性降低，致使機體發(fā)生氧化應(yīng)激，從而使得模型組沙鼠6周時肝臟出現(xiàn)了炎癥灶，8周時肝細(xì)胞破損，至16周末，在脂質(zhì)代謝紊亂與氧化應(yīng)激持續(xù)綜合作用下，動物形成中度脂肪性肝纖維化。

實驗還發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)代謝方面，6周時模型的血脂與FFA同時有所回落，除TG外，在8周時都再次升高，推測6周沙鼠對高脂飲食做出了應(yīng)激性調(diào)整。沙鼠在實驗前期1～4周內(nèi)有穩(wěn)定的高TG血癥，且沙鼠血漿中的膽固醇轉(zhuǎn)運與人類相同，即更多的依賴于低密度脂蛋白。因此，在高脂血癥模型動物的選擇中沙鼠也有很大的優(yōu)勢。

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