林英勇 吳童 聞喜英 賈惠嵐 王懷剛 趙鑫 蘇云明

蘆薈多糖對腦缺血大鼠p53蛋白表達的影響

林英勇 吳童 聞喜英 賈惠嵐 王懷剛 趙鑫 蘇云明

目的觀察蘆薈多糖(AP)對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用，并進一步探討其作用機制。方法采用線栓法阻斷大鼠一側大腦中動脈(MCAO)，制備局灶性腦缺血模型，觀察蘆薈多糖對MCAO模型大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損導致的行為學變化，通過免疫組化法檢測其對大腦皮質細胞凋亡相關蛋白p53表達的影響，以此探討蘆薈多糖對腦缺血的神經(jīng)保護作用。結果蘆薈多糖能明顯降低神經(jīng)功能缺損評分和抑制MCAO模型大鼠大腦皮質p53蛋白表達。結論蘆薈多糖對急性腦缺血具有神經(jīng)保護作用，其機制可能與蘆薈多糖影響凋亡相關蛋白p53的表達有關。

蘆薈多糖;腦缺血;細胞凋亡;p53

急性腦血管病是嚴重危害人類健康的多發(fā)病和常見病，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和高復發(fā)率的特點，是目前世界公認的三大死因之一。缺血性腦血管病(ICVD)約占所有腦血管病的75%［1］。本研究建立MCAO大鼠模型，通過觀察蘆薈多糖對大鼠腦神經(jīng)損傷的行為學改變和細胞凋亡相關蛋白p53基因表達的影響，探討蘆薈多糖對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用及其作用機制，同時也為蘆薈多糖的新藥開發(fā)及臨床應用提供理論依據(jù)［2］。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性 Wistar大鼠，體重(300±20)g，鼠齡4～5個月，由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全評價中心提供。(合格證:SYXK黑2008001)。

1.2 實驗藥品與試劑 蘆薈多糖由黑龍江中醫(yī)藥大學藥理教研室制備。尼莫地平片(20071125，西安博愛制藥有限公司)。銀杏葉片(批號:20080126，唐山榮大藥業(yè)有限公司)。p53抗體(美國SANTA Cruz公司)。PV6001二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3 實驗儀器 ZDJ-1生物組織包埋機(ZDJ-1生物組織包埋機);YT-6生物組織攤烤片機(湖北);DGX-9143B-1電熱鼓風干燥箱(上海?，?;BH-2光學顯微鏡(日本Olympus);醫(yī)用圖像分析處理系統(tǒng)(華海電子有限公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥方法 Wistar雄性大鼠隨機分成7組，每組15只。蘆薈多糖高劑量組(80 mg/kg)、中劑量組(40 mg/kg)、低劑量組(20 mg/kg)，西藥陽性對照組(尼莫地平片21.6 mg/kg)，中藥陽性對照組(銀杏葉片135 mg/kg)，模型對照組及假手術組(均給予等容積生理鹽水)。各組均連續(xù)灌胃給藥7 d，在末次給藥后30 min，對大鼠實施右側大腦中動脈阻塞模型手術。

2.2 腦缺血模型制備 大鼠采用稍加改良的Longa和Nagasawa方法［3，4］，將 Wistar大鼠制備為 MCAO 模型。大鼠腦缺血的判定及研究納入標準采取四分法評分，于MCAO術后(大鼠意識恢復后30 min)對腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺陷進行第1次神經(jīng)功能評分，評分1～3分者為合格，每組取出8只納入研究。術后24 h進行第2次神經(jīng)功能評分。

2.3 p53蛋白表達檢測 MCAO大鼠術后24 h神經(jīng)功能缺損評分后，用10%水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，快速開胸暴露心臟，剪開右心耳，經(jīng)左心室插管至升主動脈內(nèi)，灌注約150 ml左右肝素化生理鹽水，隨后滴注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液200 ml，緩慢灌注并固定。灌注完畢，從枕骨大孔剪開，完整取腦，在相同固定液中4℃固定不超過48 h。再制作病理組織片。以PV6001二步法操作，流水終止反應，蘇木素復染，清水沖洗返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片觀察。胞核或胞漿棕黃色為陽性細胞。

2.4 圖像分析 400倍光鏡下在缺血梗死灶周邊區(qū)皮質選擇5個不重疊的視場，計數(shù)陽性染色細胞數(shù)，取其平均值。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5軟件包進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以(±s)表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 AP給藥前后各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分情況，見表1。

表1 各組大鼠24 h神經(jīng)功能缺損評分的基本情況(n=8，±s)

表1 各組大鼠24 h神經(jīng)功能缺損評分的基本情況(n=8，±s)

注:模型對照組與假手術組比較:▲P＜0.05;▲▲P＜0.01;各給藥組分別與模型對照組比較:*P＜0.05;＊＊P＜0.01;

24 h模型對照組 8 等體積 2.18±0.67▲▲ 2.38±0.69組別 n(只) 劑量(mg/kg)神經(jīng)缺損分數(shù)造模后 造?！偈中g組 8 等體積 0 0蘆薈多糖高劑量組 8 80 2.36±0.71 1.67±0.55*蘆薈多糖中劑量組 8 40 2.23±0.74 1.62±0.54*蘆薈多糖低劑量組 8 20 2.24±0.72 1.95±0.85西藥陽性對照組 8 21.6 2.40±0.73 1.53±0.52*中藥陽性對照組 8 135 2.37±0.52 1.64±0.53*

表1結果顯示，AP高、中、低劑量組，西藥陽性對照組、中藥陽性對照組分別與模型對照組比較，造模24 h后神經(jīng)功能缺損評分均有不同程度的降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

3.2 AP對MCAO大鼠大腦皮質p53蛋白表達的影響，結果見表2。

表2 AP對MCAO大鼠大腦皮質p53蛋白表達的影響(n=8，±s)

注:模型對照組與假手術組比較:*P＜0.01，各給藥組分別與模型對照組比較:▲P＜0.01，▲▲P＜0.05

個視場模型對照組 8 等體積生理鹽水 18.75±2.12組別 n(只) 劑量(mg/kg) 24 h陽性細胞表達平均數(shù)(個)/5*假手術組 8 等體積生理鹽水 4.88±2.36 AP高劑量組 8 112 15.75±3.06▲▲AP中劑量組 8 56 14.88±2.80▲AP低劑量組 8 28 15.12±2.80▲▲西藥陽性對照組 8 21.6 14.25±2.76▲中藥陽性對照組 8 135 14.5±3.07▲

實驗觀察術后24 h蘆薈多糖對MCAO模型大鼠大腦皮質p53蛋白表達的影響，表2結果顯示，模型對照組與假手術組比較，p53蛋白表達均有增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。同時AP高、中、低劑量組，西藥陽性對照組、中藥陽性對照組分別與模型對照組比較，p53蛋白表達均有不同程度的降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

4 討論

腦缺血后，細胞因谷氨酸受體過量激活、鈣超載、炎癥變化、氧自由基、線粒體和DNA損傷而表現(xiàn)出壞死或凋亡兩種死亡形式。細胞壞死主要位于缺血中心區(qū)，而細胞凋亡主要出現(xiàn)在半暗帶。細胞凋亡是細胞接受導致凋亡的“信號”時，細胞內(nèi)的蛋白質被激活，啟動內(nèi)部自身基因調控機制，引起細胞自殺性死亡［1］。因此腦缺血時，抑制相關促凋亡基因的表達與調控，可以有效保護神經(jīng)元。研究表明p53是一種促凋亡基因，p53及其相關基因在腦缺血中的表達與調控，是神經(jīng)元凋亡的關鍵環(huán)節(jié)。腦損傷可導致p53的表達增加［5］，抑制p53的表達對腦缺血組織具有保護作用［6］。另有研究表明腦缺血及再灌注損傷誘導p53基因表達和細胞凋亡的出現(xiàn)是一致的［7］。

本實驗以MCAO大鼠為模型，發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖對腦缺血后p53的表達具有顯著抑制作用，從而能抑制細胞凋亡，對缺血后腦神經(jīng)起到保護作用。

［1］侯熙德.神經(jīng)病學.人民衛(wèi)生出版社，1996:197.

［2］華東，剛宏林，王志國.蘆薈藥理作用及臨床應用現(xiàn)狀.中醫(yī)藥學報，2005，33(5):54-55.

［3］Morgan JI，Curran T.Stimulus-transcription coupling in the nervous system:Involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun.Annu Rev Neurosci，1991，14:421.

［4］趙大卓，杜永強，姜波，蘇云明，等.蝙蝠葛酚性堿對腦缺血大細胞凋亡相關蛋白c-fos表達的影響.中國藥師，2009，12(8):1005-1008.

［5］Khochbin S，Lawrece J J.Processing of p53mRNA during induced differentiation ofmurine erythrolinkimia cells:is an alered splicing medianism responsible for the post transcriptional control of gene expression.Gene，1998，72:177-185.

［6］Morrison RS，Kinoshita Y，Johnson MD，et al.p53-dependent cell death signaling in neurons.Neurochem Res，2003，28:15.

［7］方媛，魏桂英，梅方武，等.腦缺血再灌注后p53表達與細胞凋亡的關系.同濟醫(yī)科大學學報，2001，30(2):158-162.

Effect of A loe Polysaccharide on protein expression of p53 in rats w ith focal cerebral ischem ia

LIN Ying-yong，WU Tong，WEN Xi-ying，et al．Department of Basic Medicine，Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang 150040，China

ObjectiveTo observe the neuro protective effects and explore the furthermechanism of Aloe Polysaccharide(AP)on cerebral ischemia in rats.MethodsWistar rats with incomplete cerebral ischemia were induced by ligating themiddle cerebral artery occlusion(MCAO)with fishing lines，It was detected the effects of Aloe Polysaccharide on protein expression of p53 with immuneohistochemicalmethod.Meanwhile，It was observed the effect of AP on the changes of ethology due to nerve injury of ratswith MCAO before and after treatments.ResultsAP can inhibit the expression of p53 protein in cerebral cortex and reduce the neurological deficit score.ConclusionAloe Polysaccharide has protecting effecton cerebral ischemia and themechanism of Aloe Polysaccharide against cerebral ischemia is related to affecting the related expression of p53 protein.

Aloe Polysaccharide;Cerebral ischemia;Cell apoptosis;p53

福建省科學技術廳重點項目(項目編號:2006Y0017)

150040黑龍江中醫(yī)藥大學(林英勇 賈惠嵐 王懷剛 趙鑫 蘇云明);福建中醫(yī)學院中醫(yī)系(吳童);牡丹江醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院藥劑科(聞喜英)

蘇云明