陳慧 邱旭

注射用阿洛西林鈉無菌檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

陳慧 邱旭

目的建立健全注射用阿洛西林鈉無菌檢查方法,保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。方法按中國藥典 2010年版二部(附錄ⅪH)無菌檢查法中的薄膜過濾法進(jìn)行。結(jié)果采用薄膜過濾法以 500ml/管緩沖液沖洗量檢查,阿洛西林鈉對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性已完全消除。結(jié)論注射用阿洛西林鈉采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查時,緩沖液沖洗量以 500ml為宜,金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均可作為陽性對照菌。該方法可作為注射用阿洛西林鈉的常規(guī)無菌檢查方法。

注射用阿洛西林鈉;無菌檢查法;方法學(xué)驗(yàn)證

阿西洛林鈉是青霉素類抗生素,第三代廣譜半合成青霉素,對G+菌、G-菌及厭氧菌有效,能強(qiáng)烈地對抗綠膿桿菌。臨床應(yīng)用于 G+菌、G-菌及厭氧菌引起的感染。本實(shí)驗(yàn)采用中國藥典 2010年版無菌檢查中的薄膜過濾法,探尋注射用阿洛西林鈉無菌檢查時適宜的檢驗(yàn)方法。

1 試驗(yàn)環(huán)境與材料

1.1 試驗(yàn)環(huán)境 在環(huán)境潔凈度萬級、局部潔凈度百級的單向流空氣的菌無室中進(jìn)行。

1.2 儀器 智能集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)、PY 330一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)、生化培養(yǎng)箱(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司)、霉菌培養(yǎng)箱(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司)、生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)

1.3 試藥 注射用阿洛西林鈉(華北制藥股份有限公司、規(guī)格 1.5g、批號:F1003603)

1.4 試驗(yàn)用菌株 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

1.5 培養(yǎng)基、稀釋液及緩沖液

1.5.1 干粉培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號:100318)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號:091019)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(091221)、瓊脂粉(000817),均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.5.2 細(xì)菌稀釋液 0.9%滅菌氯化鈉溶液(批號:2010041103)由洛陽市秦嶺制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.5.3 沖洗用緩沖液 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:20110305),由三門峽市食品藥品檢驗(yàn)所藥理室配置。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 按中國藥典 2010年版附錄ⅪH無菌檢查法菌液制備方法制備[1]。

2.2 菌落計(jì)數(shù) 取金黃色葡萄球菌菌液、大腸埃希菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液各1m l分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,生孢梭菌接種至含 1.5%瓊脂的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,經(jīng)30℃～35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24～48h,取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各 1m l分別接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中,經(jīng)23℃～28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48～72h,計(jì)數(shù)。結(jié)果見表1。(上述各菌液分別接種兩個平板,取平均值,同時設(shè)陰性對照)

表1 驗(yàn)證用菌液的稀釋級及菌落數(shù)

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組(樣品 +陽性) 取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(三聯(lián)裝)一套,先用少量 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜,取樣品 15瓶溶解于 250m l緩沖液中,按薄膜過濾法過濾,樣品過濾完畢后,再用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗,每次每管注入沖洗液 100ml,充分振搖,完全排空后循環(huán)操作 3次,總沖洗量達(dá)到 300ml每管。沖洗完畢后在2管中分別注入改良馬丁培養(yǎng)基 100ml,另 1管中注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 100m l。另取一套集菌培養(yǎng)器(三聯(lián)裝)取本品依上述方法過濾并沖洗后,均注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 100ml,將上述 6管集菌培養(yǎng)器移至陽性對照室,于含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器中,分別接種金黃色葡萄球菌菌液、大腸埃希菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、生孢梭菌菌液各 1ml,于含改良馬丁培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器中,分別接種白色念珠菌菌液和黑曲霉菌液各 1m l,按前述規(guī)定溫度培養(yǎng) 3～5d,觀察結(jié)果(見表2)。

2.3.2 陽性對照組 取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(三聯(lián)裝)二套,4管中分別注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各 100ml、2管中分別注入改良馬丁培養(yǎng)基各 100ml,在陽性對照室內(nèi)將 6種菌液分別接種至相應(yīng)管內(nèi),作為陽性對照,按前述規(guī)定溫度培養(yǎng) 3～5d,觀察結(jié)果(見表2)。

2.3.3 陰性對照組 取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(二聯(lián)裝)一套,濾過適量緩沖液后分別注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各 100ml,作為陰性對照,按前述規(guī)定溫度培養(yǎng) 14d,觀察結(jié)果(見表2)。

表2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

以上 3組平行試驗(yàn)結(jié)果表明,本品在該檢驗(yàn)量下用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以 300ml/管的沖洗量沖洗,枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌及黑曲霉管中僅需2d就發(fā)現(xiàn)有菌生長,而金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌管中 4d后才發(fā)現(xiàn)有菌生長,說明在該沖洗量下上述 2種菌的抑菌活性尚不能完全消除。因此將沖洗量增加為 500ml/管、800m l/管,同法操作,驗(yàn)證結(jié)果(見表3)。

表3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

綜合表3結(jié)果可以看出,在沖洗量為 500ml/管的條件下,對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性已完全消除,在沖洗量為 800ml/管的條件下,濾膜由輕微的破裂,導(dǎo)致試驗(yàn)失敗,無法統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

由此可以得出,本品采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查時,緩沖液的沖洗量以 500ml為最佳選擇。

2.3.4 樣品的無菌檢查 取樣品 15支依上述方法同法操作,以 500ml/管的沖洗量沖洗,加入培養(yǎng)基后,按規(guī)定溫度培養(yǎng) 14d,逐日觀察,樣品組 2管均澄清;陽性對照管培養(yǎng) 2d后,菌落生長良好;陰性對照管培養(yǎng) 14d均澄清;由此判定供試品符合規(guī)定。

3 討論

目前,抗生素類藥物的應(yīng)用非常廣泛,針對每種抗生素類藥物建立嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),提高抗生素的質(zhì)量就顯得尤為關(guān)鍵。所以對一個新品種建立無菌檢查法時,對其方法進(jìn)行驗(yàn)證就顯得尤為必要。薄膜過濾法作為無菌檢查中的一種方法,具有準(zhǔn)確、方便、快捷的優(yōu)點(diǎn),是無菌檢查時所采用的一種重要方法。

試驗(yàn)表明上述方法操作方便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確。所以,該無菌檢查方法驗(yàn)證對保證結(jié)果的可信度和準(zhǔn)確性具有重要意義。

[1] 中國藥典委員會.中國藥典 2010年版.二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

450002三門峽市食品藥品檢驗(yàn)所