于彥婷，任麗，孫春玉，蔣世翠，王義，張美萍

人參SQE基因干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

于彥婷，任麗，孫春玉，蔣世翠，王義，張美萍

目的探討SQE基因?qū)θ藚⒃碥蘸铣傻挠绊憽?/p>

方法根據(jù)SQE基因保守區(qū)序列，分別設(shè)計(jì)合成其正反義片段引物行 RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別與 pMD18-T 質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，獲得的 pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，將正反義片段與質(zhì)粒 pMHZ112 反向連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，構(gòu)建SQE基因 RNAi 雙元表達(dá)載體 pMHZ112-SQE。電擊法將鑒定正確的重組質(zhì)粒 pMHZ112-SQE 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化人參愈傷組織，提取抗性人參愈傷組織細(xì)胞基因組 DNA，進(jìn)行 PCR 檢測(cè)并計(jì)算抗性愈傷轉(zhuǎn)化率；同時(shí)提取人參皂苷，采用 HPLC 方法檢測(cè)抗性人參愈傷組織的皂苷含量。

結(jié)果結(jié)果顯示總 RNA 較完整無降解，質(zhì)量較好；RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物正反義片段大小與預(yù)期一致；重組質(zhì)粒pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A 和 pMHZ112-SQE 分別經(jīng)雙酶切進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明目的基因已插入重組質(zhì)粒且連接方向正確。人參愈傷組織細(xì)胞基因組 DNA 的PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示 1 個(gè)菌落經(jīng) 2 對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果均呈陽性，證明構(gòu)建的 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒已成功整合入植物基因組中，其抗性愈傷轉(zhuǎn)化率為 1%。轉(zhuǎn)化 pMHZ112-SQE重組質(zhì)粒后，人參抗性愈傷組織中單體皂苷 Rg1、Re、Rc 含量明顯下降，Rb1 略有升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組（轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒）間 Rg1、Re、Rb1、Rc 的含量差異顯著（均P＜ 0.05）；而 2 組均未檢測(cè)出 Rb2 和 Rd。

結(jié)論成功構(gòu)建了SQE基因 RNAi 雙元表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化人參愈傷組織抑制SQE基因的表達(dá)，可以調(diào)控人參皂苷含量發(fā)生相應(yīng)的改變。

人參； 基因； 藥物載體； 皂苷類

鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SQE）是一種單加氧酶，它是三萜皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，其基因所編碼的酶可催化鯊烯（squalene）生成 2,3-氧化鯊烯[1]。SQE 主要作用于單氧態(tài)氧化鯊烯生成 2,3-氧化鯊烯，2,3-氧化鯊烯是植物體內(nèi)甾體、皂苷、倍半萜等許多萜類衍生物質(zhì)的合成前體，這些物質(zhì)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育或抗病過程中具有重要作用。據(jù)目前研究表明，SQE基因在不同物種中均有表達(dá)[2-4]。RNA 干擾（RNAi）主要是通過雙鏈 RNA 的介導(dǎo)，特異性地降解相應(yīng)序列的靶mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)，是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默方法[5]。為了進(jìn)一步研究SQE基因在人參皂苷合成途徑中的作用，本研究根據(jù) RNAi原理，以SQE為靶基因，構(gòu)建SQE基因植物高效 RNAi 雙元表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化人參愈傷組織，進(jìn)而分析轉(zhuǎn)化前后單體皂苷含量的變化，以期為揭示人參中關(guān)鍵酶基因的功能、提高皂苷含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 5年生人參葉采自吉林省汪清縣，并利用其誘導(dǎo)獲得人參愈傷組織細(xì)胞。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌菌株E.coliDH5α和農(nóng)桿菌 GV3101 均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室保存提供；pMD18-T 質(zhì)粒購自天根生化科技（北京）有限公司；植物雙元表達(dá)質(zhì)粒 pMHZ112為本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建。

1.1.3 主要試劑與儀器 總 RNA 提取劑（Trizol-A+）購自天根生化科技（北京）有限公司；第一鏈 cDNA 合成試劑盒、T4 DNA 連接酶購自富酶泰斯生物技術(shù)（深圳）有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaI、BamHI、XhoI、HindIII 購自寶生物工程（大連）有限公司；其他生化試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。梯度 PCR 儀和恒溫金屬浴均購自杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考注冊(cè)的五加科植物鯊烯環(huán)氧酶基因 AB003516、AB122078、FJ393274、EU131089、DQ457054、DQ386734 序列進(jìn)行比對(duì)，找到SQE基因的保守區(qū)域位于 1135 ～1469 bp。然后根據(jù)其保守區(qū)的基因信息，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件 DNA star 和 NTI9.0 設(shè)計(jì)人參 SQE 干擾片段的引物，同時(shí)根據(jù)載體的多克隆位點(diǎn)及應(yīng)用Primier5.0 對(duì)片段進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析后，在正義片段 S 上下游引物中分別引入XbaI、BamHI 酶切位點(diǎn)，反義片段 A 上下游引物中分別引入XhoI、HindIII 酶切位點(diǎn)。其中正義片段 S 上游引物 S1序列為 5’ TGCTCTAGACACTTTTATTAGGGGAT GC 3’，下游引物 S2 序列為 5’ CGCGGATCCAAG AAGTGGAGAAATAGGC 3’；反義片段 A 上游引物 A1 序列為 5’ CCGCTCGAGCACTTTTATTAG GGGATGC 3’，下游引物 A2 序列為 5’ CCCAAGC TTAAGAAGTGGAGAAATAGGC 3’；丙酮酸脫氫酶激酶內(nèi)含子（PDK Intron）上游引物 P1 序列為5’ AGCGAATTCTAGTATAAAATAGTTAAGTG 3’，下游引物 P2 序列為 5’ ATGGAATTCCAATCCAA ATGTAAGATC 3’。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2SQE基因 RNAi 雙元表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建策略見圖 1。利用 Trizol 法提取人參葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以 cDNA 為模板，分別以 S1/S2 和 A1/A2 為引物，通過 RT-PCR 方法克隆SQE基因正義及反義片段，然后在 T4 DNA 連接酶作用下分別與 pMD18-T 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，獲得SQE基因正反義干擾片段，經(jīng)雙酶切后測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為 pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A。提取pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A 質(zhì)粒，分別用XbaI、BamHI 和XhoI、HindIII 雙酶切正反義片段及質(zhì)粒 pMHZ112，回收相應(yīng) DNA 片段，用T4 DNA 連接酶將正反義片段與質(zhì)粒 pMHZ112反向連接，連接后的載體轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，置于5 ml含 15 mg/L 四環(huán)素的 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進(jìn)行 PCR 鑒定。將轉(zhuǎn)化大腸桿菌成功的重組質(zhì)粒命名為 pMHZ112-SQE，并利用 PDK 引物進(jìn)行方向性鑒定。

圖 1 SQE基因RNAi雙元表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Figure 1 Schematic diagram of RNAi binary expression vector construction of SQE genes

1.2.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染人參愈傷組織 利用電擊法將鑒定正確的重組質(zhì)粒 pMHZ112-SQE 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后細(xì)胞置于含有 15 mg/L 四環(huán)素的 LB 固體平板中，28 ℃ 倒置培養(yǎng) 2 ～ 3 d 后，挑取單菌落進(jìn)行 PCR 鑒定。將人參愈傷組織加入裝有農(nóng)桿菌菌液（A550值為 0.6）的三角瓶中，侵染 8 ～ 10 min 后轉(zhuǎn)移至含有0.5 mg/L 芐氨基嘌呤（BA）、0.1 mg/L 萘乙酸（NAA）的 MS 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，23 ℃ 暗培養(yǎng)3 d 后，再轉(zhuǎn)入含有 0.5 mg/L BA、0.1 mg/L NAA、400 mg/L頭孢霉素（Cef）的 MS 抑菌培養(yǎng)基中，23 ℃ 暗培養(yǎng) 7 d，每 2 d 更換 1 次培養(yǎng)基。最后轉(zhuǎn)至含有 0.5 mg/L BA、0.1 mg/L NAA、20 mg/L 卡那霉素（Kan）的 MS 篩選培養(yǎng)基中，每隔 7 d 更換 1 次培養(yǎng)基，篩選抗性人參愈傷組織細(xì)胞。

提取陽性人參愈傷組織細(xì)胞基因組 DNA，分別用引物 S1/P2 和 A2/P1 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，并取擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。1 個(gè)菌落經(jīng) 2 對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果均呈陽性，則證明構(gòu)建的 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒已成功整合入植物基因組中。同時(shí)選擇 3 個(gè)批次穩(wěn)定生長(zhǎng)的陽性人參愈傷組織細(xì)胞，每個(gè)批次分別隨機(jī)抽取 20 瓶進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證后，計(jì)算抗性愈傷轉(zhuǎn)化率。

1.2.4 皂苷含量測(cè)定 選擇 PCR 檢測(cè)呈陽性的人參愈傷組織，按照參考文獻(xiàn)[6]以索氏提取法提取人參皂苷。實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)化 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組和轉(zhuǎn)化 pMHZ112 空質(zhì)粒的對(duì)照組，采用 HPLC 方法，測(cè)定人參皂苷中 6 種主要單體皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的含量，并比較分析各單體皂苷的含量差異。HPLC 色譜條件：Hypersil-C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；水-乙腈（41∶9）流動(dòng)相；柱溫 35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，進(jìn)樣量 20 μl，流速為 1.3000 ml/min；采用梯度洗脫方式。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組單體皂苷含量的比較采用方差分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正反義片段 SQE-S 和 SQE-A 的克隆與鑒定

以 5年生人參葉片為材料提取總 RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示 28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA 特征條帶清晰，表明總 RNA 比較完整無降解，質(zhì)量較好，符合后續(xù)功能基因克隆、表達(dá)的要求（圖 2）。

圖 2 人參總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳分析Figure 2 Agarose gel electrophoresis analysis of ginseng total RNA

利用提取的總 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 模板，分別以 S1/S2 和 A1/A2 為引物 PCR 擴(kuò)增SQE 基因正義片段 S 與反義片段 A，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在 364 bp 處均可見單一明顯特異性條帶，與預(yù)期的 DNA 表達(dá)片段大小一致（圖 3）。

圖 3 SQE 基因正義片段 S 與反義片段 A 的 PCR 擴(kuò)增Figure 3 The results of sense-S and the antisense-A by PCR amplification

pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A 分別經(jīng)雙酶切后進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果分別可見大小約為364 bp 和 2700 bp 的SQE基因正反義片段和pMD18-T 質(zhì)粒條帶，證明目的基因已插入重組質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致（圖 4、5）。

圖 4 pMD18-T-SQE-S 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Figure 4 Identification of recombinant plasmid pMD18-TSQE-S by double restriction enzyme digestion

圖 5 pMD18-T-SQE-A 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Figure 5 Identification of recombinant plasmid pMD18-TSQE-A by double restriction enzyme digestion

2.2 雙元表達(dá)載體 pMHZ112-SQE 的構(gòu)建

將 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶XbaI 與HindIII、XhoI 與BamHI 雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別可見大小約為 1 kb 和28.1 kb 的 S/A+PDK 和 pMHZ112 質(zhì)粒條帶，表明SQE基因連接方向正確，pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖 6）。

2.3 pMHZ112-SQE 轉(zhuǎn)化人參愈傷組織的PCR檢測(cè)

提取陽性人參愈傷組織細(xì)胞基因組 DNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示 1 個(gè)菌落經(jīng) 2 對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果均呈陽性（圖 7）。對(duì) 3 個(gè)批次陽性人參愈傷組織細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果表明，抗性愈傷轉(zhuǎn)化率為 1%。

圖 6 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Figure 6 Identification of recombinant plasmid pMHZ112-SQE by double restriction enzyme digestion

圖 7 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人參愈傷組織的 PCR檢測(cè)Figure 7 The PCR detection of ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

圖 8 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人參愈傷組織中 6 種單體皂苷的含量Figure 8 The content of 6 saponin monomer in ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

2.4 pMHZ112-SQE 轉(zhuǎn)化人參愈傷組織的皂苷含量

提取陽性人參愈傷組織的人參皂苷，HPLC 法測(cè)定 6 種主要單體皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的含量，結(jié)果在轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒和 pMHZ112-SQE重組質(zhì)粒的人參愈傷組織中均檢測(cè)出 Rg1、Re、Rb1、Rc 這 4 種單體皂苷，并且與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 Rg1、Re、Rc 的含量大幅度下降，而Rb1 的含量則略有增加；但兩組均未檢測(cè)出 Rb2和 Rd 這 2 種單體皂苷（圖 8）。由此可見，通過RNAi 干擾抑制SQE基因的表達(dá)，可以使人參單體皂苷含量發(fā)生相應(yīng)的改變。

利用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒的人參愈傷組織中皂苷含量進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示 2 組間單體皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc 含量差異顯著（均P＜0.05），而 Rb2、Rd 在 2 組中含量均為 0，不存在差異（表 1）。

表 1 pMHZ112-SQE 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人參愈傷組織中皂苷含量的差異性分析Table 1 The difference analysis of saponin monomer content in ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

3 討論

人參的次生代謝十分復(fù)雜，至今為止雖然不斷有相關(guān)報(bào)道，但人參皂苷的合成途徑尚不清楚。SQE是皂苷合成途徑過程中最后一個(gè)通用酶[7]，在隨后的催化反應(yīng)中可產(chǎn)生植物激素、植物甾醇或皂苷三萜類化合物，其基因所編碼的酶催化鯊烯生成的2,3-氧化鯊烯，在經(jīng)過一系列的質(zhì)子化、環(huán)化、重排和去質(zhì)子化作用后可形成三萜皂苷元[8]。

SQE 是人參皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，理論上通過抑制SQE基因的表達(dá)，可使人參皂苷的含量有所降低。本研究結(jié)果表明，RNA 干擾后人參單體皂苷 Rg1、Re、Rc 含量下降，而 Rb1 的含量則有所升高，其原因可能是 RNA 干擾的不徹底，由于干擾時(shí)存在底物的競(jìng)爭(zhēng)性，從而導(dǎo)致干擾后含量的增加；其次，干擾效果還受轉(zhuǎn)化材料的限制，轉(zhuǎn)化的人參愈傷組織比較松散，除菌不夠徹底，可能存在部分假陽性現(xiàn)象；再次，RNA 干擾是一個(gè)復(fù)雜的過程，是多基因協(xié)同作用的結(jié)果，人參皂苷合成也是一個(gè)復(fù)雜的過程，其相關(guān)酶與相關(guān)酶之間、相關(guān)酶與皂苷之間相互聯(lián)系、相互作用，只抑制某一單基因的表達(dá)，對(duì)次生代謝終產(chǎn)物含量不會(huì)有顯著影響。

總之，本研究在成功構(gòu)建SQE基因 RNAi 雙元表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)化人參愈傷組織檢測(cè)分析表明 RNAi 可使人參單體皂苷含量發(fā)生相應(yīng)的改變，為了解皂苷合成中關(guān)鍵酶和皂苷合成的相關(guān)機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):121-126

The construction and transformation of GinsengSQEgene interference vector

YU Yan-ting, REN Li, SUN Chun-yu, JIANG Shi-cui, WANG Yi, ZHANG Mei-ping

ObjectiveTo explore the effects ofSQEgene on ginsenoside synthetic.

MethodsAccording to the conservative region sequence ofSQEgene, primers of the sense and antisense fragments were designed and synthetized respectively for RT-PCR, and the amplification products were connected with plasmid pMD18-T, then transformed into theE.coliDH5α.After the obtained recombinant plasmids pMD18-T-SQE-S, pMD18-T-SQE-A were double-enzyme digested,the sense and antisense fragments were subsequently inserted reversely to plasmid pMHZ112, then transformed intoE.coliDH5α to construct the pMHZ112-SQE, which was the RNAi binary expression vector ofSQEgene.The correctly identified recombinant plasmid pMHZ112-SQE was transformed into the GV3101 Agrobacterium competent cells by electrotransformation, then transformed the ginseng callus by Agrobacterium-mediated approach.The genomic DNA of resistant ginseng callus were extracted for PCR, and calculated resistance ginseng callus transformation ratio; Simultaneously, the ginsenosides were extracted to detect the ginsenosides content of resistance ginseng callus by HPLC.

ResultsRT-PCR result showed that the total RNA was intact and had better quality without degradation; the sense and antisense PCR amplification fragments were consistent with the expected sequences.After the recombinant plasmids pMD18-T-SQE-S,pMD18-T-SQE-A and pMHZ112-SQE were identified by double restriction enzyme digestion, the results showed that the target gene was inserted into the recombinant plasmid with correct orientation.The PCR results of ginseng callus genomic DNA showed that the amplification results of one colony with two pairs of primers were all positive, proving that the recombinant plasmid pMHZ112-SQE was integrated into the plant genome successfully, and the transformation ratio of resistant ginseng callus was 1%.After transformation of the recombinant plasmid pMHZ112-SQE, the contents of monomer saponin Rg1、Re、Rc were measurablly reduced,and Rb1 was insignificant increased in resistance ginseng callus.The contents of Rg1、Re、Rb1、Rc between experimental group and control group (transformed by empty plasmid) had significant difference (P＜ 0.05); and neither of them showed detectable monomer saponin Rb2 and Rd.

Conclusion The RNAi binary expression vector ofSQEgene was constructed successfully, and the ginsenosides content could be controlled accordingly by inhibiting the expression ofSQEgene in ginseng callus.

GINSENG; Genes; Drug carriers; SAPONINS

ZHANG Mei-ping, Email: wzhaoyun@tom.com

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(2):121-126

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.008

130118 長(zhǎng)春，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室

張美萍，Email：wzhaoyun@tom.com

2011-01-11

Author Affiliation: Cell Engineering Laboratory of Life Science College, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

·綜述·