毛曉韻，范垂鋒，魏晶，劉崇，姚凡，金鋒

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，普通外科教研室，乳腺外科，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變p53外顯子突變的研究

毛曉韻1，范垂鋒2，魏晶1，劉崇1，姚凡1，金鋒1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，普通外科教研室，乳腺外科，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

目的腫瘤抑制基因p53突變是浸潤(rùn)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中常見(jiàn)事件，而其與包括普通型增生（UDH），不典型增生（ADH）及導(dǎo)管內(nèi)原位癌（DCIS）的乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變關(guān)系不明。探討p53在乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變的外顯子突變情況，以期了解p53突變?cè)谌橄侔┌l(fā)生發(fā)展中的作用。方法 用高分辨率熔解曲線和測(cè)序研究122例乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變中p53外顯子5～8的突變情況。結(jié)果 經(jīng)HRM篩選，14例患者DNA熔解曲線與野生型標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線大于閾值，經(jīng)測(cè)序分析，其中13例出現(xiàn)p53外顯子突變。35例UDH中均未發(fā)現(xiàn)突變，10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS發(fā)現(xiàn)至少1個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變，其中1例DCIS發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)的突變。結(jié)論p53突變發(fā)生于乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變中的ADH與DCIS，其可能為乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的早期事件。

乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變；p53突變；高分辨率熔解；DNA測(cè)序

p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，突變型p53蛋白表達(dá)對(duì)乳腺癌的臨床分期和預(yù)后產(chǎn)生負(fù)性影響［1］。乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變是一組形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、與乳腺癌關(guān)系十分密切的病變［2］。其主要發(fā)生于終末導(dǎo)管小葉單位，少數(shù)發(fā)生于大導(dǎo)管和輸乳管，包括普通型導(dǎo)管增生（usual ductal hyperplasia，UDH）、非典型導(dǎo)管增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）和導(dǎo)管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS），與發(fā)生浸潤(rùn)性乳腺癌的危險(xiǎn)性相關(guān)［3］。目前，有關(guān)p53與乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變，特別是與乳腺導(dǎo)管內(nèi)非典型增生病變相關(guān)性的研究報(bào)道較少，其在中國(guó)人群突變情況未見(jiàn)報(bào)道。高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）技術(shù)是近年來(lái)在傳統(tǒng)突變檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種用于突變掃描和基因分型的新技術(shù)，其原理在于熔解曲線的變化取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的序列、長(zhǎng)度和堿基組成，通過(guò)熔解曲線的變化反映核酸性質(zhì)的差異，是應(yīng)用熔解曲線對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的新方法［4，5］。以前大量研究表明，95%的p53突變發(fā)生于高度保守的外顯子5～8區(qū)域，且在所有p53突變形式中，常見(jiàn)的是因點(diǎn)突變引起的錯(cuò)義突變，而缺失或插入突變都是較少發(fā)生的［8］。在本研究中，我們通過(guò)HRM和基因測(cè)序研究p53外顯子5～8在乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變中的突變，以期了解其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科2007年6月至2009年10月女性新鮮不伴癌的乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變標(biāo)本122例（UDH35例，ADH 56例，DCIS 31例），年齡18～72歲，中位年齡37.6歲。患者術(shù)前均未經(jīng)放化療，其病理經(jīng)2位病理醫(yī)生按世界衛(wèi)生組織（WHO）《乳腺病理組織學(xué)分類》（2003新版）標(biāo)準(zhǔn)讀片確認(rèn)其病理類型，-80℃保存。

1.2 DNA提取

每例均經(jīng)冰凍切片HE染色，確認(rèn)病理類型和定位，用酚氯仿法提取乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變組織DNA，用NanoDrop 1000紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸質(zhì)量及濃度，并全部標(biāo)準(zhǔn)化為10ng/μl。

1.3 HRM檢測(cè)

p53基因第5、6、7和8外顯子HRM PCR引物及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。20μl HRM PCR反應(yīng)體系含10ng基因組 DNA，上下游引物各 20μmol，MgCl21.5mmol，2×Light Cycler誖 480High Resolution Master Mix（羅氏公司，德國(guó)）10μl，以野生型標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照。加樣完成后，使用Roche專用貼膜將96孔PCR反應(yīng)板封住，液體充分混勻后置Roche Lightcycler 480中檢測(cè)。PCR循環(huán)條件為94℃變性15min，然后進(jìn)入94℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸25s循環(huán)，循環(huán)45次，最后72℃延伸5min。HRM 過(guò)程：95℃ 1min，40℃ 1min，65℃ 1s，再以每秒1℃的速度從65℃升至95℃，Light Cycler誖480系統(tǒng)特有的基因掃描軟件于升溫過(guò)程中每度檢測(cè)40次熒光，計(jì)算出熔解曲線圖。

表1p 53外顯子引物及P C R產(chǎn)物長(zhǎng)度T a b.1p 53p r i me r s a n d P C Rp r o d u c t s i z e Exon Sequence（5'→3'） Size（bp）5 Fwd：TTCCTCTTCCTGCAGTACTC Rev：CAGCTGCTCACCATCGCTAT 6 Fwd：CACTGATTGCTCTTAGGTCT Rev：AGTTGCAAACCAGACCTCAG 7 Fwd：GTGTTATCTCCTAGGTTGGC Rev：CAAGTGGCTCCTGACCTGGA 8 Fwd：CCTATCCTGAGTAGTGGTAA Rev：TCCTGCTTGCTTACCTCGCT 210144144165

1.4 HRM產(chǎn)物的測(cè)序分析

用相應(yīng)引物擴(kuò)增、純化和回收通過(guò)HRM篩出的突變樣品，置ABI 3730測(cè)序儀測(cè)序（上海生工公司）。

2 結(jié)果

經(jīng)HRM分析，共14例患者DNA熔解曲線與野生型標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線大于閾值，結(jié)合測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中13例出現(xiàn)p53外顯子突變（圖1，2，表2）。35例 UDH 中均未發(fā)現(xiàn)突變，10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS發(fā)現(xiàn)至少1個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變，其中1例DCIS發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)的突變。突變位點(diǎn)依據(jù)國(guó)際公共p53突變數(shù)據(jù)庫(kù)（The universal mutation p53database，UMDp53database，http：//p53.free.fr/）查出其在人類腫瘤的突變頻率。在所發(fā)現(xiàn)的14個(gè)p53突變位點(diǎn)中，有2例突變位于第五外顯子，3例突變位于第6外顯子，4例突變位于第7外顯子，5例突變位于第8外顯子。

?

3 討論

以往檢測(cè)致病突變的主要方法有PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針、PCR-測(cè)序、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性等，以上方法不僅費(fèi)用高，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法開(kāi)展致病基因的大規(guī)模突變篩查［6］。HRM利用PCR后擴(kuò)增子的核苷酸序列和長(zhǎng)度不同而引起的各堿基含量的差異，通過(guò)不同溫度下實(shí)時(shí)檢測(cè)升溫過(guò)程的熔解曲線來(lái)反映DNA鏈中單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的基因變化?？梢哉f(shuō)，核苷酸的排列和配對(duì)堿基不同是其熔解溫度產(chǎn)生差異的根本原因。HRM通過(guò)這種實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，判斷升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，進(jìn)行p53突變的初篩。有研究用HRM及測(cè)序方法對(duì)比研究了47個(gè)樣本中p53的突變情況，發(fā)現(xiàn)HRM的敏感性達(dá)到1.0，特異性達(dá)到0.83［7］，我們研究中發(fā)現(xiàn)HRM篩出14位點(diǎn)的p53突變，測(cè)序結(jié)果表明其中13個(gè)為錯(cuò)義突變，1個(gè)未出現(xiàn)突變，特異性高。且其不受堿基突變位點(diǎn)和種類的局限，其不僅能夠?qū)σ阎蛔冞M(jìn)行分析，對(duì)未知突變的篩查、掃描和短片段重復(fù)序列的分析也有理想的檢測(cè)效果。其還能縮短操作時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟，大大降低使用成本，并且實(shí)現(xiàn)真正的閉管操作，最大限度地避免交叉污染。

腫瘤抑制基因p53在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中都起著重要的作用。p53基因突變是目前所知人體腫瘤最常見(jiàn)的基因改變，在許多腫瘤的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，該基因突變對(duì)乳腺癌的臨床分期和預(yù)后產(chǎn)生負(fù)性影響。乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變主要發(fā)生于終末導(dǎo)管小葉單位，少數(shù)發(fā)生于大導(dǎo)管和輸乳管，與發(fā)生浸潤(rùn)性乳腺癌的危險(xiǎn)性相關(guān)。長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)，UDH是正常人的1.5倍，ADH為4～5倍，DCIS為8～10倍。普通型導(dǎo)管增生是一種以成二級(jí)管腔和中央增生細(xì)胞呈水流樣分布為特征的良性導(dǎo)管增生，WHO工作小組認(rèn)為UDH不是一種有意義的乳腺癌危險(xiǎn)因素。Allred等［9］認(rèn)為UDH沒(méi)有p53基因突變和p53蛋白表達(dá)，除非是出現(xiàn)在Li-Fraumeni患者的遺傳性突變。我們研究發(fā)現(xiàn)10.7%的乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變存在p53突變，在所研究的35例UDH中均未發(fā)現(xiàn)p53突變，這與Allred等［9］的觀點(diǎn)吻合。近期一項(xiàng)比較基因組雜交研究提示，UDH中的一部分可以是ADH的前驅(qū)病變。ADH是一種以分布均勻的單形細(xì)胞增生為特征的腫瘤性導(dǎo)管內(nèi)病變，進(jìn)展為浸潤(rùn)性乳腺癌的危險(xiǎn)性為中度。DCIS也是一種腫瘤性導(dǎo)管內(nèi)病變，其特征為導(dǎo)管上皮細(xì)胞呈顯著增生，伴輕微至明顯的異型性，有發(fā)展為浸潤(rùn)性乳腺癌的傾向。目前關(guān)于在ADH病變中p53突變的觀點(diǎn)有爭(zhēng)議。Done等［10］用PCR-SSCP在21例乳腺增生性病變中均未發(fā)現(xiàn)p53突變，其中包括1例ADH，其認(rèn)為p53突變出現(xiàn)于DCIS階段。Keohavong等［11］檢測(cè)了6例DCIS和10例ADH的p53突變，發(fā)現(xiàn)在其中3例DCIS和5例ADH中存在p53突變，認(rèn)為p53突變不僅出現(xiàn)于DCIS，也出現(xiàn)于ADH等。我們發(fā)現(xiàn)10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS至少存在 1個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變，其中1例DCIS發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)的突變，提示p53突變參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，且其可能為惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的早期事件。我們?cè)贏DH和DCIS中發(fā)現(xiàn)的p53突變位點(diǎn)及點(diǎn)突變類型在UMDp53突變數(shù)據(jù)庫(kù)中均能找到，且出現(xiàn)了突變頻率很高的幾處突變類型（R175H，A273C，R248Q），這些點(diǎn)突變與p53蛋白結(jié)構(gòu)與功能改變密切相關(guān)。p53基因突變?cè)谌橄侔┌l(fā)生發(fā)展中的作用及意義，還需要我們進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，追蹤隨訪來(lái)驗(yàn)證和完善。

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（編輯裘孝琦，英文編輯鄭華川）

Mutation ofp53Exon in Breast Intraductal Proliferative Lesions

MAO Xiao-yun1，F(xiàn)AN Chui-feng2，WEI Jing1，LIU Chong1，YAO Fan1，JIN Feng1
（1.Department of Surgical Oncology，Research Unit of General Surgery，Department of Breast Surgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveAlthoughp53mutation is one of the most common alterations identified in invasive breast carcinomas，it is not clear whether its alteration frequently occurs in intraductal proliferative lesions including usual ductal hyperplasia（UDH），atypical ductal hyperplasia（ADH）and ductal carcinoma in situ（DCIS）.The aim of this study is to investigate thep53mutation in intraductal proliferative lesions，and clarify its significance in breast carcinogenesis.Methodsp53mutation was examined in 122cases of noninvasive breast lesions including UDH，ADH and DCIS by high-resolution melting（HRM），followed by DNA sequence.ResultsThe positive rates ofp53mutation were 0.0%，10.7%and 22.6%in UDH，ADH and DCIS，respectively.Conclusionp53mutation occurs in intraductal proliferative lesions including ADH and DCIS，and might be an early event in breast carcinogenesis.

intraductal proliferative lesions；p53mutation；high-resolution melting；DNA sequence analysis

R737．3

A

0258-4646（2011）01-0060-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30950009）

毛曉韻（1979-），女，住院醫(yī)師，博士.

金鋒，E-mail：jinfeng66cn@hotmail.com

2010-10-05