楊曉丹，李巨

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121001；2.沈陽(yáng)軍區(qū)第202醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 130001）

SELDI篩選絨癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株耐藥相關(guān)蛋白

楊曉丹1，李巨2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121001；2.沈陽(yáng)軍區(qū)第202醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 130001）

目的應(yīng)用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合蛋白芯片分析篩選人絨毛癌細(xì)胞株JAR及其與人絨毛癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株JAR/MTX之間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，尋找出絨癌耐藥的相關(guān)蛋白。方法 采用體外細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)提取兩種細(xì)胞的胞漿蛋白和分泌蛋白，應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞株提取的胞漿蛋白和分泌蛋白，采用CM-10型弱陽(yáng)離子交換芯片檢測(cè)。結(jié)果 經(jīng)SELDI技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比（m/z）為8132.043，10738.36的胞漿蛋白在JAR/MTX細(xì)胞中呈高表達(dá)；質(zhì)荷比（m/z）為11555.09的分泌蛋白及m/z為4896.68的胞漿蛋白在JAR細(xì)胞中高表達(dá)，在JAR/MTX中呈低表達(dá)。結(jié)論應(yīng)用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合弱陽(yáng)離子交換芯片，可有效篩選絨癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株中的特異性表達(dá)蛋白；尋找到的差異蛋白與絨癌耐藥密切相關(guān)，并可能成為本病耐藥的標(biāo)志物。

滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；JAR細(xì)胞株；JAR/MTX細(xì)胞株；蛋白芯片；差異蛋白；飛行時(shí)間質(zhì)譜；表面增強(qiáng)激光解吸離子化

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（gestational trophoblastic tumour，GTT）是一組來(lái)源于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的腫瘤，它類似于腫瘤細(xì)胞，有增殖、分化、侵襲的特點(diǎn)。由于其獨(dú)特的組織學(xué)來(lái)源和生物學(xué)行為以及對(duì)化療的敏感性，絨癌已成為最早可以治愈的實(shí)體腫瘤。然而對(duì)于耐藥患者的治療效果卻難以令人滿意而成為治療的難題，從而需要不斷探索本病出現(xiàn)耐藥的機(jī)理及新的治療方法以解決這類病人的耐藥問(wèn)題。

目前臨床上關(guān)于腫瘤耐藥的檢查手段具有自限性和滯后性，蛋白質(zhì)組學(xué)［1］高靈敏度和特異性的分析技術(shù)有助于捕獲腫瘤演變過(guò)程中細(xì)微的分子變化，使之成為診斷和監(jiān)測(cè)腫瘤演進(jìn)的重要線索，特別是差異蛋白組織學(xué)問(wèn)世，人們應(yīng)用SELD-TOF-MS技術(shù)表面加強(qiáng)的激光解析/電離化時(shí)間—飛行質(zhì)譜儀結(jié)合配套的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)［2］，已經(jīng)篩選出了乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等十余種腫瘤的血清特異性蛋白質(zhì)。本研究通過(guò)檢測(cè)人絨癌細(xì)胞株JAR和耐藥細(xì)胞株JAR/MTX兩種細(xì)胞株的蛋白質(zhì)指紋圖譜，以尋找與人絨癌耐藥密切相關(guān)的蛋白，進(jìn)一步探討絨癌耐藥的原因，并為深入研究絨癌耐藥的標(biāo)志物提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株JAR/MTX購(gòu)于浙江醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院；人絨毛膜癌細(xì)胞株JAR購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。

1.1.2 主要試劑及儀器：胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)HyCLone公司，U9（9mol/L Urea，2%CHAPS），乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA），尿素，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），HPLC水等均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司的色譜級(jí)產(chǎn)品，蛋白提取試劑盒及BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物公司，蛋白質(zhì)芯片時(shí)間質(zhì)譜飛行儀（PBSIIC）及其CM-10型弱陽(yáng)離子交換芯片購(gòu)于美國(guó)Ciphergen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇液氮凍存JAR及JAR/MTX細(xì)胞株，常規(guī)培養(yǎng)含10%的胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱飽和濕度下傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分泌蛋白的提?。捍齼煞N細(xì)胞生長(zhǎng)率為90%左右，PBS沖洗細(xì)胞3次，更換不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。離心管收集同種細(xì)胞培養(yǎng)基，超濾離心濃縮，置于-80℃保存。

1.2.3 細(xì)胞胞漿蛋白的提?。喊?0～14μl/cm2加入細(xì)胞裂解液，冰上孵育30min，收集同種細(xì)胞裂解液，10000r/min低溫離心30min，取上清分裝，置于-80℃保存。

1.2.4 CM-10型蛋白芯片操作步驟：樣品冰上融解后，10000r/min，4℃，離心2min。取96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，放冰盒上；取出芯片，裝入生物芯片處理器，在芯片上加 10μl U9，每孔分別再加 5μl樣品，600r/min4℃，振蕩 30min；加 200μl 50mmol/L pH 4.0NaAC，用力拍干。加 200μl NaAC 600r/min 5min 3次（常溫）。每孔加入200μl HPLC水，迅速甩干。待芯片表面自然晾干后，各點(diǎn)加SPA0.5μL，重復(fù)一次后用蛋白芯片閱讀機(jī)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜的檢測(cè)分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析：采用CM-10型蛋白芯片機(jī)進(jìn)行檢測(cè)篩選，并用PBSIIC型蛋白芯片閱讀機(jī)讀取芯片的信息，儀器參數(shù)設(shè)置為：初始激光強(qiáng)度190，檢測(cè)敏感度 7，質(zhì)荷比（m/z）為 Mr2000～20000的蛋白峰。由于受金屬離子及基質(zhì)的影響本研究將m/z小于2500的基質(zhì)峰排除。采用美國(guó)Ciphergen Protein Software 3.2.0版本的分析軟件生成的數(shù)據(jù)，然后用 Biommarker Wizard軟件分析 JAR，JAR/MTX，兩組間峰值差異P值。

2 結(jié)果

2.1 人絨毛膜癌細(xì)胞株（JAR）與人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株（JAR/MTX）之間分泌蛋白的差異性表達(dá)

應(yīng)用CM-10型蛋白芯片檢測(cè)人絨毛膜癌細(xì)胞株（JAR）與人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株（JAR/MTX）所提取的分泌蛋白，并采用Biommarker Wizard軟件分析后顯示，兩組間的蛋白圖譜存在差異蛋白峰，其m/z為11555的蛋白在JAR中呈高表達(dá)，在 JAR/MTX 中呈低表達(dá)（P＜0.05）（圖 1）。

2.2 人絨毛膜癌細(xì)胞株（JAR）與人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株（JAR/MTX）之間胞漿蛋白的差異性

應(yīng)用CM-10型蛋白芯片檢測(cè)人絨毛膜癌細(xì)胞株（JAR）與人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株（JAR/MTX）所提取的胞漿蛋白，采用Biommarker Wizard軟件分析后顯示，兩組間的蛋白圖譜存在3個(gè)差異蛋白峰，m/z分別為8132，10738在JAR/MTX中呈高表達(dá)，4896在JAR中高表達(dá)（P＜0.05）（圖2）。

3 討論

研究表明，腫瘤的發(fā)生早期就可在蛋白水平發(fā)生結(jié)構(gòu)上重要的改變，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，有許多不同功能性的蛋白參與其中，蛋白表達(dá)異常不僅包括了蛋白量表達(dá)的增多或減少，還有蛋白加工翻譯后的改變，這些都可能影響到腫瘤的發(fā)展過(guò)程及生物學(xué)行為。SELDI-TOF-MS根據(jù)蛋白質(zhì)芯片表面不同的修飾M特性，選擇性地捕獲樣品中與之特異性結(jié)合的蛋白，具有簡(jiǎn)單、快速、敏感、高通量、粗樣本和上樣量少的特點(diǎn)［2］。本實(shí)驗(yàn)利用此技術(shù)檢測(cè)了絨癌細(xì)胞株JAR與絨癌耐氨甲喋呤細(xì)胞株JAR/MTX的蛋白質(zhì)圖譜，CM-10型芯片利用它弱陽(yáng)離子的特性，其表面有弱陰離子羧基，可以與被分析物表面的正電荷集團(tuán)相互作用而捕獲正電荷蛋白［3］。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，每種細(xì)胞收獲3次，以排出組間差別；每份樣品在同種芯片3個(gè)以上不同點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以排除不同芯片間點(diǎn)之間的差異。通過(guò)比較蛋白質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，在兩種細(xì)胞株中有4個(gè)蛋白質(zhì)峰有明顯變化。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在提取的胞漿蛋白中人絨癌耐氨甲喋呤JAR/MTX的細(xì)胞株中Mr 8132，10738蛋白表達(dá)明顯升高，而4896在JAR細(xì)胞中呈高表達(dá)。表明JAR/MTX細(xì)胞株出現(xiàn)耐藥可能與8132，10738蛋白的升高有關(guān)。當(dāng)然，上述篩選出的差異蛋白還需要從相應(yīng)的血清和組織標(biāo)本中進(jìn)一步證實(shí)和鑒定。

體外培養(yǎng)的細(xì)胞株雖然不能完全反應(yīng)體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和生物學(xué)活性，但它具有成分單一、均質(zhì)性好、實(shí)驗(yàn)條件容易控制等優(yōu)點(diǎn)。尤其在做對(duì)比性研究時(shí)可避免有組織細(xì)胞成分復(fù)雜，細(xì)胞異質(zhì)性高等缺點(diǎn)造成的結(jié)果不真實(shí)和不可靠［4］。我們培養(yǎng)了JAR，JAR/MTX細(xì)胞，裂解細(xì)胞蛋白后，SELDI-TOFMS分析蛋白表達(dá)的差異。絨癌在發(fā)生，發(fā)展過(guò)程中其細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變化可以反映到血清中，可從體外培養(yǎng)的絨癌細(xì)胞株中篩選出部分與癌癥病人血清中相一致的標(biāo)志蛋白，這部分蛋白可能就是與耐藥的發(fā)生密切相關(guān)的功能蛋白或調(diào)節(jié)蛋白。

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)目前已廣泛用于臨床各種疾病的研究中，已經(jīng)篩選出了乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等十余種腫瘤的血清特異性蛋白質(zhì)［5］，目前對(duì)絨癌耐藥方面相關(guān)研究甚少，而關(guān)于本病耐藥特異蛋白的研究除本課題組的報(bào)告外未見(jiàn)其他報(bào)道。由于該技術(shù)的應(yīng)用成本相對(duì)較高，對(duì)技術(shù)的掌握和熟練程度還需提高。小分子量蛋白質(zhì)的檢測(cè)仍然沒(méi)有像大分子量蛋白質(zhì)檢測(cè)那么容易，質(zhì)譜檢測(cè)出的蛋白質(zhì)不能直接鑒定，必須通過(guò)后續(xù)的檢測(cè)方法判斷蛋白質(zhì)的種類，這些都限制了該技術(shù)在臨床領(lǐng)域大規(guī)模的運(yùn)用［6］。

［1］Lim JY，Cho JY，Paik YH，et al.Diagnost-ic application of serum proteomic patterns in gastric cancer patients by proteinchip surfaceenhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry［J］.Int J Biol Markers，2007，22（4）：281-286.

［2］MerchantM，Weinberger SR.Recent advancements in surface enhanced laser desorp tion/ionization time of flight mass spectrometry［J］.Ctrophoresis，2000，21（6）：1164-1771.

［3］Xu WH，Chen YD，Hu Y，et al.Preoperatively molecular staging with CM10ProteinChip and SELDI-TOF-MS for colorectal cancer patients［J］.Zhejiang Univ Sci B，2006，7（3）：235-240.

［4］夏梁，蔡偉麗，張麗麗，等.體外培養(yǎng)的不同亞型肺癌細(xì)胞株差異蛋白的初步分析［J］.現(xiàn)代儀器，2004，1：13-17.

［5］Issaq HJ，Conrads TP，Prieto DA，et al.SELDITOF MS for diagnostic proteomics［J］.Anal Chem，2003，75（7）：148A-155A.

［6］KasK.Onthetechnicalitiesofdiscoveringandapplyingproteinbiomarkers for cancer prevention［J］.Eur J Cancer Prevention，2004，13（5）：437-446.

（編輯孫憲民，英文編輯鄭華川）

Screening Resistance-related Protein in JAR/MTX Cell Line by SELDI

YANG Xiao-dan1，LI Ju2
（1.Department of Obsterics and Gynecology，The First Affiliated Hoppital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2.Department of Obsterics and Gynecology，No.202Hospital of the Chinese People′s Liberation Army，Shenyang 110003，China）

ObjectiveThis study aimed to analyze the differences between the human placenta cancer cell line JAR and the methotrexateresistant JAR/MTX and screen out the drug resistance-associated proteins in the choriocarcinoma.MethodsThe protein was extracted from culture cell and to examine the cytoplasmic and secreted proteins using the surface-enhanced laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry（SELDI-TOF-MS）.This cell lines were tested using CM-10weak cation exchanging protein chip.ResultsThe cytosolic proteins with mass charge ratio（m/z）of 8132.043，10738.36in the cytoplasmic protein was highly expressed in JAR/MTX cells.The secreted protein with mass charge ratio （m/z）of 11555.09and the cytolosic protein with the mass charge ratio（m/z）of the 4896.68was highly expressed in JAR cells，but lowly in JAR/MTX cells.ConclusionThe combination of the time of flight mass spectrometry technology with a weak cation exchanging protein chip might effectively screen specific proteins of MTX-resistant choriocarcinoma cell line and explore the relation between protein expression and drug resistance in the choriocarcinoma.

gestational trophoblastic tumour；protein chip；differentially expressed protein；time of flight-mass spectrometry；surface-enhanced laser desorption and ionization

R73-35+1；R730.231

A

0258-4646（2011）01-0045-03

楊曉丹（1983-），女，碩士.

李巨，E-mail：lxz3110@163.com

2010-04-01