趙雅寧，李建民，陳長香，李淑杏

（河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)系，河北 唐山 063000）

睡眠剝奪對大鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬IL-1β表達(dá)的影響及SB203580干預(yù)作用

趙雅寧，李建民，陳長香，李淑杏

（河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)系，河北 唐山 063000）

目的睡眠剝奪（SD）對大鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬IL-1β表達(dá)的影響及SB203580干預(yù)作用。方法 90只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成對照組、模型組、SB203580干預(yù)組。改良多平臺法建立SD模型。光鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化，免疫組化法和Western blot法檢測海馬區(qū)IL-1β蛋白的表達(dá)，水迷宮法測試動物學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果 與對照組比較，模型組中，隨睡眠剝奪時間延長，SD大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷明顯，存活神經(jīng)元密度降低、IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)及表達(dá)增多，動物學(xué)習(xí)記憶能力減退；與模型組比較，SB203580組中腦組織形態(tài)損傷程度減輕、存活神經(jīng)元密度增加、IL-1β表達(dá)回降，動物學(xué)習(xí)記憶功能得到改善。結(jié)論SD可增加海馬IL-1β表達(dá)，引起動物認(rèn)知功能障礙，SB203580可能通過降低海馬IL-1β表達(dá)，改善SD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

睡眠剝奪；白細(xì)胞介素1；學(xué)習(xí)記憶

睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）是指由于各種原因引起的睡眠丟失狀態(tài)。隨著生活節(jié)奏的加快，社會壓力的增大等，睡眠剝奪已成為現(xiàn)代社會的普遍現(xiàn)象，是睡眠醫(yī)學(xué)所關(guān)注的主要研究內(nèi)容之一。來自臨床的資料顯示，睡眠剝奪可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降、注意力分散、定向障礙等認(rèn)知功能改變［1］。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）是中樞神經(jīng)和免疫系統(tǒng)相互作用的關(guān)鍵信使之一，其不僅調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的諸多生理活動，并廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如Alzheimer's病（AD）、腦卒中的病理生理過程［2］。但I(xiàn)L-1β與SD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙是否有關(guān)尚不清楚。本實驗通過觀察不同睡眠剝奪時間對大鼠海馬IL-1β表達(dá)的影響，探討IL-1β在睡眠剝奪（SD）大鼠認(rèn)知障礙中的作用；同時本研究引入p38MAPK信號抑制劑SB203580，對SD后IL-1β表達(dá)的信號做初步的探討。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型制備

雄性SD大鼠90只（北京維通利華公司，合格證：SCXK（京）2002-003），體質(zhì)量（330±20）g，隨機(jī)分為對照組（30只）、模型組（30只）和SB203580干預(yù)組（30只），每組平均分為SD1d、3d、5d 3個亞組。

采用改良多平臺法制備異相睡眠剝奪模型。睡眠剝奪箱大小為30cm×30cm×150cm，中央放置一直徑為6cm，高8cm的平臺。剝奪箱內(nèi)注有水，水面低于平臺2cm水溫保持在（20±2）℃。大鼠可在平臺上進(jìn)入睡眠時，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，造成睡眠剝奪。對照組除平臺增大為直徑13cm，其余因素與SD組一致，大鼠在大平臺上進(jìn)入睡眠。SB203580干預(yù)組的實驗條件，造模前30min經(jīng)尾靜脈靜脈注射，劑量0.5μg/kg，以后，每隔24h注射一次，連續(xù)給藥5d。

1.2 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察（HE染色）

各組動物在規(guī)定時間點0.4%戊巴比妥納麻醉動物，開胸、暴露心臟，4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，在視交叉處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片（片厚5μm），進(jìn)行HE染色。每只鼠連續(xù)3張冠狀背側(cè)海馬切片，采用圖像分析儀（美國Bio-Rad公司）計數(shù)正常神經(jīng)元，取均值。

1.3 IL-1β免疫組化

切片常規(guī)脫蠟至水，參照試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）說明進(jìn)行免疫組化染色。陽性率的定量分析：每個標(biāo)本取4張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬隨機(jī)選取4個視野，用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）對各組陽性細(xì)胞進(jìn)行吸光度（absorbance，A）分析。

1.4 免疫印跡法測定海馬區(qū)IL-1β

脫頸法處死大鼠，斷頭取腦，分離海馬，加入裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心 5min，3000r/min，取上清，考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量，樣品制備，轉(zhuǎn)膜、加入抗體（IL-1β，1∶1500；β-actin，1∶1000）、封閉、ECL 顯色。Bio-Rad系統(tǒng)進(jìn)行吸光度測定，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平，進(jìn)行半定量分析。

1.5 學(xué)習(xí)和記憶功能檢測

按照Smith等［3］的方法，采用Morris水迷宮進(jìn)行檢測，上午、下午各一次，記錄各組大鼠搜索安全島（即平臺）潛伏期時間（單位時間：s）；和撤去平臺后動物穿越原平臺位置的次數(shù)，取檢測記錄的總均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

對照組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊致密；模型組中，SD 1d海馬神經(jīng)元出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞水腫，隨時間延長至3d、5d，細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷時，視野內(nèi)可見壞死改變的神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞周圍空隙增寬、胞核皺縮濃染等，存活神經(jīng)元密度明顯減少（P<0.05）；SB203580干預(yù)組存活神經(jīng)元密度均增加（P<0.05）。（表 1、圖 1）。

表1各組海馬區(qū)的神經(jīng)元密度比較（n=15，±s）T a b.1C o mp a r i s o n o f n e u r o n d e n s i t y i n h i p p o c a mp a l r e g i o n（n=15，±s）Group 1d 3d 5d Control group 26.33±4.27 26.53±4.56 25.93±4.17Model group 20.15±3.901） 18.85±3.781） 13.52±2.681）SB203580group 23.93±3.572） 22.86±3.572） 23.03±3.882）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

2.2 IL-1β免疫組化和免疫印跡結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示IL-1β陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿。陽性細(xì)胞的胞質(zhì)可見細(xì)小的棕黃色顆粒。對照組大鼠海馬區(qū)只有極少量的陽性細(xì)胞，染色較淡。SD后1d、3d、5d IL-1β陽性細(xì)胞呈不同程度增加，染色棕黃，陽性細(xì)胞主要分布在海馬易敏感區(qū)CA1區(qū)、其次在CA2、CA3區(qū)，齒狀回也有少量有分布；SB203580組中IL-1β陽性細(xì)胞減少，染色變淡。免疫印跡定量結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組中IL-1β蛋白水平在相應(yīng)時間點明顯上調(diào)，SD5d達(dá)高峰（P<0.05）；SB20358干預(yù)組中IL-1β蛋白水平下降（P<0.05）。（表 2、圖 2）。

表2各組I L-1β蛋白表達(dá)水平比較（±s）T a b.2C o mp a r i s o n o f I L-1β e x p r e s s i o n i n e a c h g r o u p（±s）Group 1d 3d 5d Control group 0.40±0.17 0.52±0.15 0.48±0.12Model group 3.56±1.191） 4.60±1.291） 7.68±2.561）SB203580group 1.58±0.472） 1.88±0.492） 4.45±1.232）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.表3各組大鼠水迷宮檢測結(jié)果（±s）T a b.3Mo r r i s w a t e r ma z e i n e a c h g r o u p（±s）Groups Latency to find the platform Time of passing the platform 1d 3d 5d 1d 3d 5d Control group 55.5±7.5 54.7±6.3 55.8±6.5 8.20±1.52 8.25±1.62 8.31±1.58Model group 92.5±21.81） 105.6±24.51） 120.8±28.01） 5.08±1.111） 4.25±1.221） 2.28±1.001）SB203580group 62.0±16.72） 70.5±20.72） 84.8±22.82） 6.98±1.322） 5.68±1.122） 4.17±1.152）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

2.3 學(xué)習(xí)記憶功能結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠搜索安全島潛伏期明顯延長、穿越原平臺位置的次數(shù)減少（P＜0.05）；SB20358干預(yù)可縮短大鼠搜索安全島潛伏期時間、增多穿越原平臺位置的次數(shù)（P＜0.05，表3）。

3 討論

睡眠是人類日常生活中的必要組成部分，不僅涉及體溫調(diào)節(jié)、免疫功能的維持等，亦能促進(jìn)記憶的鞏固，使其轉(zhuǎn)化成更加穩(wěn)定的狀態(tài)。有數(shù)據(jù)顯示，剝奪睡眠超過24h，可導(dǎo)致人認(rèn)知能力下降30%～70%［1］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者開展了睡眠剝奪對認(rèn)知功能的影響，但相關(guān)機(jī)制尚需深入研究。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)IL-1β生物功能與其濃度有關(guān)。生理情況下，IL-1參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)神經(jīng)元的生長發(fā)育以及記憶等。而當(dāng)腦受到缺氧、缺血刺激時，IL-1β異常升高，高濃度IL-1β可抑制海馬部位神經(jīng)元的興奮性和突觸功能從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［4］。MaAfoose等［5］認(rèn)為高濃度 IL-1β 可直接影響長時程增強(qiáng)（LTP）或神經(jīng)的發(fā)生引起學(xué)習(xí)記憶缺陷。本研究觀察與認(rèn)知功能密切區(qū)域-海馬區(qū)IL-1β表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨睡眠剝奪時間延長，模型組中海馬區(qū)IL-1β較對照組表達(dá)明顯增高；結(jié)果還顯示隨睡眠剝奪時間延長，模型組中動物搜索安全島潛伏期與穿越原平臺位置的次數(shù)較對照組差異顯著，說明睡眠剝奪能使IL-1β表達(dá)增多。推測睡眠剝奪后，腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，相對敏感性較強(qiáng)的海馬區(qū)IL-1β表達(dá)增高，從而引起動物學(xué)習(xí)和記憶功能受損。

實驗證實，IL-1β主要通過p38有絲分裂原活化 蛋 白 激 酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號途徑參與多種疾病如腦卒中、AD病等病理過程［6，7］。即 p38MAPK 活性越強(qiáng)，IL-1β 表達(dá)越高，同時高濃度的IL-1β可進(jìn)一步增加p38MAPK信號活性。研究顯示P38MAMPK對腦損傷后的神經(jīng)功能起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［8，9］。本研究，應(yīng)用 p38MAPK 蛋白特異性抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)，初步探討p38MAPK與睡眠剝奪認(rèn)知功能、IL-1β之間的關(guān)系。結(jié)果顯示：與模型組比較，SB203580干預(yù)組中動物學(xué)習(xí)記憶功能得到改善、海馬區(qū)神經(jīng)元存活密度增加、IL-1β表達(dá)，提示p38MAPK信號途徑和IL-1β可能是睡眠剝奪認(rèn)知功能障礙重要機(jī)制之一，睡眠剝奪可能通過影響p38MAPK/IL-1β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而損害機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶功能；而SB203580通過抑制SD后p38MAPK信號通路活化級聯(lián)反應(yīng)，下調(diào)IL-1β表達(dá)，最終促進(jìn)了學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)。有關(guān)SD后p38MAPK信號活化的具體機(jī)制尚需深入研究。

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（編輯孫憲民，英文編輯鄭華川）

Effect of Sleep Deprivation on Learning-memory and Hippocampal IL-1β in Rats and the Role of SB203580Intervention

ZHAO Ya-ning，LI Jian-min，CHEN Chang-xiang，LI Shu-xing
（Department of Rehabilitation Medicine for Hebei United university，Tangshan 063000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of sleep deprivation （SD）on learning-memory and hippocampal IL-1β in Rats and the role of SB203580intervention.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups：control，model，SB203580-treated groups.SD models were established by the modified multiple platform methods.Morphological changes were observed with light microscopy.The IL-1β expression was examined by immunohistochemistry and Western blot.Learning and memory function was monitored with Morris water maze.ResultsCompared with control group，neuronal structure was obviously damaged，the density of survival neurons decreased，the IL-1β expression increased and learning and memory function significantly decreased with time of SD in model group.Compared with model group，the density of survival neurons was increased，IL-1β expression obviously decreased，but the ability of learning and memory function enhanced in SB203580-treated group（P ＜ 0.05）.Conclusions SD could increase IL-1β expression and finally result in cognition injury.However，SB203580improved learning-memory function by attenuating IL-1β expression.

sleep deprivation；interleukin-1β；learning-memory

R338.6

A

0258-4646（2011）01-0030-04

河北省科技廳支撐項目（2009276103D-7）

趙雅寧（1974-），女，副教授，碩士.

李建民，E-mail：lijianmints@sina.com

2010-09-09