劉春來，劉嘉，劉屹立，王平

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110032）

熱療對膀胱癌細胞耐藥性的影響

劉春來，劉嘉，劉屹立，王平

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110032）

目的探討熱療對膀胱癌細胞耐藥性的影響。方法 不同溫度條件下熱療與化療聯(lián)合作用耐藥膀胱癌細胞株BIU-87后，用MTT法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期、細胞凋亡和survivin表達的變化。結果 熱療可顯著增強羥基喜樹堿對BIU-87的抑制作用，并可減少survivin的表達。熱療可以誘導BIU-87的凋亡，并呈溫度依賴性。結論熱療可增強化療藥物作用，部分逆轉(zhuǎn)膀胱癌細胞的耐藥性，并促進凋亡。

膀胱移行細胞癌；BIU-87細胞株；熱療；凋亡；生存素

膀胱腫瘤多藥耐藥性的存在常導致臨床膀胱灌注化療失敗。臨床報道熱療可逆轉(zhuǎn)膀胱移行細胞癌的耐藥性，但其機制尚不清楚。本研究擬在體外培養(yǎng)條件下，對熱療逆轉(zhuǎn)耐藥膀胱癌細胞株的多藥耐藥性的可行性及效果進行判定，探討熱療在膀胱癌耐藥性逆轉(zhuǎn)發(fā)生過程中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

對羥基喜樹堿耐藥的膀胱癌細胞株BIU-87，由北京大學泌尿外科研究所提供。羥基喜樹堿、四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙錠、小鼠抗人survivin單抗及小鼠抗人同型對照IgG、羊抗小鼠IgG-FITC、AnnexinⅤ-FITC試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：BIU-87細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液RPMI 1640含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。細胞為上皮樣貼壁生長，每2～3d傳代1次。取生長期細胞接種于培養(yǎng)瓶中，24～48h后待細胞處于指數(shù)生長期，取出細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法：細胞濃度為 2.5×104/ml，每孔加 100μl接種于3塊96孔板，待6h細胞貼壁后，試驗組加羥基喜樹堿至終濃度為0.01mg/ml，置于37℃、39℃、41℃、43℃，對照組加PBS，作用2h后去除含藥培養(yǎng)液。培養(yǎng)24、48和72h后，每孔加MTT（5mg/ml，美國 Sigma 公司）20μl孵育 4h，棄上清，加入DMSO 150μl，酶標儀570nm處測吸光度A值。設3個復孔取均值，試驗重復3次，按下列公式計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=（1-實驗組A值/對照組A值）×100。

1.2.3 流式細胞術檢測survivin的表達：BIU-87細胞5瓶，試驗組加羥基喜樹堿至終濃度為0.01mg/ml，置于 37℃、39℃、41℃、43℃，對照組加 PBS作用2h后去除含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)72h后，4%多聚甲醛4℃固定20min，PBS洗滌，加入含0.25%Triton X2100的PBS室溫破膜10min，PBS洗滌，分別加入100μl小鼠抗人survivin單抗及小鼠抗人同型對照IgG（1∶100稀釋），室溫孵育 30min，再加入100μl FITC標記的羊抗小鼠 IgG（1∶100稀釋），4℃避光孵育20min，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。流式細胞術檢測以同型對照管設置陽性界值，survivin抗原表達水平以平均熒光強度表示，試驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期及凋亡：BIU-87細胞5瓶，試驗組加羥基喜樹堿至終濃度為0.01mg/ml置于37℃、39℃、41℃、43℃，對照組加PBS作用2h后去除含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)72h后，70%乙醇固定細胞，加入碘化丙錠和AnnexinⅤ-FITC 4℃避光染色30min，放入流式細胞儀的樣品室，進行檢測，試驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

?

各標本均計數(shù)1×104個細胞，所有資料經(jīng)Cell Quest軟件收集分析。采用SPSS 10.0軟件，方差分析檢驗各組間的差異，兩兩比較采用SNK法，Dunnettt檢驗分析各試驗組與對照組間的差異。P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熱療對BIU-87細胞生長的影響

熱療使細胞生長受到抑制，單純熱療組不同溫度組間細胞抑制率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其抑制程度具有溫度依賴性；單純熱療組與熱療聯(lián)合化療組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），熱療明顯增加化療的作用。見表1。

2.2 熱療對BIU-87細胞凋亡及周期的影響

單純熱療組中凋亡細胞百分比及SubG0/G1期細胞百分比39℃、41℃、43℃與37℃比較明顯增多（P＜0.05），作用呈溫度依賴性。DNA含量分析顯示單純熱療組G2/M期細胞所占比例39℃、41℃、43℃與37℃比較明顯減?。≒＜0.05）。單純熱療與熱療聯(lián)合化療組比較，凋亡細胞百分比及Sub G0/G1期細胞百分比有統(tǒng)計學差異，熱療明顯增加化療的作用。見表2。

表2熱療和熱療聯(lián)合化療對B I U-87細胞作用72h后細胞周期及凋亡變化的影響（%）T a b.2C e l l c y c l e c h a n g e s a f t e r 72h o u r s t r e a t e d b y h y p e r t h e r mi a a n d c h e mo t h e r a p y（%）G0/G1 S G2/M SubG0/G1 Apoptosis Control Chemotherapy ControlChemotherapy Control Chemotherapy Control Chemotherapy ControlChemotherapy 37℃ 73.21 74.33 15.54 17.82 5.62 2.43 5.63 5.42 4.76 4.8239℃ 81.93 82.12 9.41 8.65 1.021） 0 7.641） 9.232） 6.131） 8.402）41℃ 85.89 83.68 4.79 2.68 01） 0 9.321） 13.642） 8.791） 12.962）43℃ 86.58 81.43 1.12 0.55 01） 0 12.301） 18.022） 11.071） 16.452）1）P＜0.05vs 37℃；2）P＜0.05vs control group.Temperature

2.3 熱療對BIU-87細胞survivin表達的影響

經(jīng)37℃、39℃、41℃、43℃作用后，BIU-87細胞survivin表達減少，單純熱療組不同溫度間有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），呈溫度依賴性減少。見表3。

3 討論

近年來熱療因其安全有效且不良反應低已越來越多地應用于惡性腫瘤綜合治療中。熱療能選擇性地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞沒有影響。溫度在40℃～43℃之間，對腫瘤細胞發(fā)揮最大效應，溫度低于40℃，對腫瘤細胞影響作用小，大于43℃～45℃，腫瘤細胞主要表現(xiàn)為壞死［1］。本研究熱療溫度選擇在37℃～43℃，建立不同作用時間、不同溫度下熱療對BIU-87細胞細胞株作用的生長抑制曲線，發(fā)現(xiàn)熱療對BIU-87細胞生長有明顯的抑制作用，并且抑制作用呈溫度依賴性。應用流式細胞儀檢測熱療對BIU-87細胞細胞周期及凋亡，提示熱療促進BIU-87細胞細胞的凋亡，其促進凋亡的作用呈溫度依賴性。

表3熱療和熱療聯(lián)合化療對B I U-87細胞作用72h后s u r v i v i n表達的影響（±s，%）T a b.3S u r v i v i ne x p r e s s i o na f t e r 72h o u r st r e a t e db yh y p e r t h e rmi a a n d c h e mo t h e r a p y（±s，%）Survivin Control Chemotherapy 37℃ 5.60±2.24 4.60±1.8339℃ 3.20±1.361） 2.20±0.9541℃ 0.70±0.211） 0.52±0.1843℃ 0.20±0.061） 0.13±0.041）P＜0.05vs 37℃.Temperature

膀胱移行癌是泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，其中75%～85%為淺表性膀胱癌，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術后行膀胱灌注化療5年內(nèi)復發(fā)率高達24%～84%。其高表達多藥耐藥基因是膀胱腫瘤耐藥的主要原因，機制之一是耐藥基因在不同組織中表達差異性有關，與P糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白、肺耐藥相關蛋白、谷胱甘肽或谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶過度表達、拓撲異構酶Ⅱ活性降低或含量減少、DNA損傷修復能力加強、ras基因的活化和Bcl-2的高表達等也關系密切。多項研究表明熱療聯(lián)合化療可以提高腫瘤治療的療效［2］，膀胱熱灌注化療是治療非肌層浸潤性膀胱癌的一種重要方法，可以明顯降低復發(fā)率。本研究通過不同作用時間、不同溫度下羥基喜樹堿對BIU-87細胞作用，發(fā)現(xiàn)熱療對化療有明顯增強作用，促進BIU-87細胞細胞的凋亡，其作用呈溫度依賴性。

熱療已成為人們關注的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的熱點之一。本研究發(fā)現(xiàn)熱療可部分逆轉(zhuǎn)BIU-87細胞的耐藥性。Leng等［3］報道熱療可以逆轉(zhuǎn)舌鱗癌細胞Tca8113/CBDEA 的耐藥性。Agostineli等［4］研究也得到相同結果。有文獻報道［5，6］熱療合并藥物膀胱灌注治療淺表性膀胱癌的療效，絲裂霉素C 20mg溶于50ml蒸餾水經(jīng)尿道注入膀胱內(nèi)，灌藥后立即進行915MHz微波偶極子輻射透熱膀胱區(qū)，膀胱內(nèi)溫度透熱41℃～44℃，每次1h。1年后隨訪，復發(fā)率為14.3%，2年后隨訪復發(fā)率為24.6%?；颊甙螂诅R檢查分化程度及級別沒有進展。與單純化療藥物和（或）卡介苗膀胱灌注相比，熱化療治療膀胱癌是安全有效的方法，特別對于曾卡介苗膀胱灌注失敗的患者。

熱療逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機制復雜，熱療可以促進化療藥物誘發(fā)細胞凋亡的過程，誘導凋亡相關基因的表達發(fā)生改變［7］，與腫瘤熱療相關的凋亡基因有p53、Fas、Bcl-2、c-myc、c-fos等，已有研究證實靶向survivin的siRNA能抑制腫瘤細胞的增殖，可以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，促進其凋亡。survivin是凋亡抑制蛋白家族重要成員之一，是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強的細胞凋亡抑制因子，不僅抑制細胞凋亡，還參與了細胞周期的調(diào)控和新生血管的生成。研究表明［8］，survivin高表達于膀胱腫瘤中，是導致膀胱癌復發(fā)的可能性因素。耐藥肺癌細胞株中survivin表達較非耐藥者高，survivin過度表達可能會幫助腫瘤細胞克服G2/M期的凋亡檢測點并且促進變形細胞通過有絲分裂的變異進程［9］。survivin參與腫瘤細胞的耐藥，腫瘤細胞內(nèi)這些抑制蛋白水平升高是腫瘤細胞逃避抗癌藥物殺傷作用的原因之一［10］。Liu等［11］使用 siRNA 技術敲除胰腺癌細胞中的survivin后發(fā)現(xiàn)明顯增強吉西他濱的敏感性。Wang等［12］應用2種survivin siRNA靶向治療骨肉瘤細胞MG-63可以顯著促進細胞凋亡，并且增加阿霉素及順鉑的藥物敏感性。本研究結果表明，BIU-87細胞中survivin的表達隨溫度的增高而逐漸降低，據(jù)此可推測，熱療通過降低survivin表達增強了BIU-87細胞對羥基喜樹堿的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)其耐藥性，最終誘導BIU-87細胞的凋亡。但熱療通過何種途徑導致腫瘤細胞凋亡和逆轉(zhuǎn)其耐藥性增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性還需要深入探討。

本研究結果初步表明，熱療對人膀胱癌細胞株BIU-87有抑制其生長、增殖和誘導凋亡的作用，可部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥且呈現(xiàn)溫度依賴性。熱化療不良反應小，可應用于膀胱灌注治療和輔助治療膀胱癌，特別對于治療卡介苗膀胱灌注失敗的患者是安全有效的治療方法。

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（編輯陳 姜，英文編輯鄭華川）

The Effect of Hyperthermia on Multidrug Resistance in Bladder Cancer Cells

LIU Chun-lai，LIU Jia，LIU Yi-li，WANG Ping
（Department of Urology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo investigate the effect of hyperthermia on multidrug resistance in BIU-87cell line.MethodsBIU-87cells were treated by hydroxycamptothecin at different temperature （37℃～43℃），and then subjected to the proliferation assay by MTT.The expression of survivin，cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.ResultsHyperthermia enhanced the inhibitory effects of hydroxycamptothecin on BIU-87cells and reduced the expression of survivin.Hyperthemia could induce the apoptosis of BIU-87cell in temperaturedependant manner.ConclusionHyperthermia can enhance the inhibition rate of chemotherapeutics drugs，partially reverse the multidrug resistance and induce the apoptosis of BIU-87cells.

bladder transitional cell carcinoma；BIU-87cell line；hyperthermia；apoptosis；survivin

R737.14

A

0258-4646（2011）01-0023-04

遼寧省博士啟動基金資助項目（20101139）

劉春來（1974-），男，主治醫(yī)師，博士.E-mail：lcllmh@126.com

2010-07-16