譚斐，吳曉黎，景良，李桂晨，趙琛，郭陽

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110004）

硫酸軟骨素蛋白多糖抑制神經(jīng)元軸突生長體外生物模型的建立

譚斐，吳曉黎，景良，李桂晨，趙琛，郭陽

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110004）

目的利用硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG）的生物特性建立抑制神經(jīng)元生長和軸突再生的體外生物模型。方法 將不同濃度CSPG與無生物毒性的德克薩斯紅熒光染料混合，取5μl滴在培養(yǎng)板的中心部位，形成邊界清楚的紅色圓形斑點(diǎn)，稱CSPG圓斑（CSPG SPOT）。將神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞和小鼠小腦顆粒細(xì)胞（CGNs）鋪在含有CSPG SPOT的培養(yǎng)板中，48h后觀察細(xì)胞的生長情況。結(jié)果 含有1μg/ml和3μg/ml CSPG的SPOT分別使CGNs和神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞停止生長、死亡，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的軸突延伸到SPOT上生長。高濃度的CSPG可滲透到SPOT周圍區(qū)域，使CSPG SPOT周圍區(qū)域的細(xì)胞生長和軸突再生受到抑制。結(jié)論該模型可以在體外模擬膠質(zhì)細(xì)胞分泌的CSPG對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長的抑制作用，對(duì)研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元的生長和軸突的再生具有廣泛的應(yīng)用前景。

硫酸軟骨素蛋白多糖；細(xì)胞生長；軸突延伸；小腦顆粒細(xì)胞；神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）軸突損傷后無法再生，可能與CNS髓鞘脂和膠質(zhì)瘢痕的抑制作用有關(guān)。在CNS損傷后，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性活化、增殖，形成膠質(zhì)瘢痕。膠質(zhì)瘢痕及其分泌的以硫酸軟骨素蛋白多糖 （chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGS）為主的大量抑制因子，嚴(yán)重阻礙軸突再生［1］。因此改善CNS損傷后的微環(huán)境可能有利于細(xì)胞的生長和軸突的再生，從而促進(jìn)CNS損傷后神經(jīng)組織及其功能的恢復(fù)。CSPGs代表一組復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)大分子，在哺乳動(dòng)物的CNS中含量豐富，是由核心蛋白和含有硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）二糖重復(fù)單位的糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）組成的蛋白多糖，以跨膜蛋白和分泌蛋白兩種形式存在［2］。研究發(fā)現(xiàn)，CNS損傷后病變周圍區(qū)域CSPGs表達(dá)水平升高［3，4］，而 CNS 受損后神經(jīng)元軸突再生受到抑制與CSPGs的高表達(dá)有關(guān)［5，6］。目前，對(duì)CSPGs引起的神經(jīng)元軸突抑制機(jī)理的研究以及如何阻斷這種抑制作用已成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱門課題，這就使得建立有效的體外研究模型成為迫切的需要。本文詳細(xì)描述CSPGs圓形斑點(diǎn)的特點(diǎn)和使用，并探討這一體外生物模型的適用性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

本研究使用具有神經(jīng)元特性的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系—SY5Y細(xì)胞和體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元-新生小鼠小腦顆粒細(xì)胞神經(jīng)元（cerebellar granule neurons，CGNs）進(jìn)行模型的研究。SY5Y細(xì)胞在含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 RMPI 1640（Sigma-Aldrich公司）培養(yǎng)液中于37℃孵育箱中培養(yǎng)。CGNs首先從活體小鼠中獲得，然后在Neurobasal medium A（Invitrogen-GIBCO公司）培養(yǎng)液中于37℃孵育箱中培養(yǎng)。

1.2 小鼠CGNs的分離與培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)板的處理：24孔塑料培養(yǎng)板，每個(gè)孔用無菌鑷放入一個(gè)載玻片，然后每個(gè)孔再加入50μg/ml的多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）200μl，使載玻片浸入PLL液體中。靜置120min后用純蒸餾水沖洗2次，在通風(fēng)廚中風(fēng)干后用錫紙包好放4℃冰箱待用。

1.2.2 細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：小鼠（C57BL/6）CGNs的培養(yǎng)使用以 Levi［7］和 Romero［8］培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)的改進(jìn)方法［9］。取出生后7d的小鼠、斷頭。術(shù)者左手持鑷子固定小鼠頭部，右手持剪子從小鼠頭部兩側(cè)迅速剪開皮膚和顱骨，然后用彎剪向上掀起小鼠后顱骨，暴露出小腦和部分大腦，用鑷子輕輕剝離整個(gè)小腦，每2個(gè)小腦放入1個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿事先盛有2ml冰預(yù)冷的Hank’s液。在解剖顯微鏡下仔細(xì)分離掉小腦上的軟腦膜和血管。重復(fù)上述步驟，直到收集夠?qū)嶒?yàn)所用的小腦。用鑷子把小腦轉(zhuǎn)移到盛有4ml Hank’s液的培養(yǎng)皿中，再用解剖剪剪碎小腦，加4ml 0.25%Trypsin，輕輕地?fù)u勻，并在37℃水浴箱中孵育10min。之后再加含有10%FBS的培養(yǎng)液5～6ml終止Trypsin的消化作用。轉(zhuǎn)入15ml細(xì)胞培養(yǎng)管，500r/min，離心5min。徹底傾倒上清后加入5ml含有5%DNaseⅠ（1∶20，0.25ml DNaseⅠ 溶在 4.75ml DMEM 液中）的DMEM。用力搖勻并反復(fù)吸打使之變成均勻一致的混濁液后經(jīng)過40μm篩網(wǎng)過濾。500r/min離心過濾液5min。傾倒上清后加入Neurobasal medium A（Invitrogen）培養(yǎng)液（B27+Glutamin+25mmol/L KCL+1%Pen-Strep）2～3ml，用移液器輕輕地吸放，使細(xì)胞溶解于培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞的密度為（3～6）×104/ml，接種入24孔板中。再轉(zhuǎn)入溫度為37℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 CSPG SPOT的制備

將不同量的CSPG（Sigma公司）與無毒的德克薩斯紅熒光染料（Invitrogen公司）混合配制成不同濃度的 CSPG 混合液，分別是 0，0.5，1.0，3.0，5.0和10μg/ml。取含有不同濃度的 CSPG 混合液 5μl分別滴到事先用PLL覆蓋好的培養(yǎng)板底部的載玻片上，5μl的小液滴形成一個(gè)紅色的略帶突起的圓形斑塊，紅色是德克薩斯紅的顏色。室溫下靜置2h，注意保濕，防止5μl的液滴蒸發(fā)。然后用1×PBS液沖洗2遍，風(fēng)干后備用。這樣，在培養(yǎng)板底部載玻片的中心部位有一邊緣整齊的紅色圓斑（SPOT），沿著SPOT的邊緣形成了一個(gè)CSPG/PLL界面。界面內(nèi)是圓形斑塊，均勻地分布著含有一定濃度的CSPG，界面的外邊是PLL德克薩斯紅的顏色使SPOT與周圍區(qū)域非常容易在熒光顯微鏡下分開。鋪入細(xì)胞后，雖然細(xì)胞在同一個(gè)培養(yǎng)皿中，但處于不同位置的細(xì)胞生長環(huán)境不一樣，便于觀察對(duì)比。將準(zhǔn)備好的SY5Y細(xì)胞和制備好的CGNs0.5ml移到含有CSPGSPOT的培養(yǎng)板底部的載玻片上，于37℃孵育箱中培養(yǎng)24h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞軸突生長情況并拍攝照片。

1.4 細(xì)胞免疫熒光染色

（1）細(xì)胞準(zhǔn)備：將神經(jīng)細(xì)胞接種到預(yù)先放置24張6mm×22mm蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，蓋玻片上有事先制備好的CSPG SPOT。待細(xì)胞生長成熟和貼壁后，取出蓋玻片，用 1×PBS（0.01mol/L，pH7.4）洗 3次。（2）法固定細(xì)胞：用4%多聚甲醛固定液（paraformaldehyde，PFA） 室溫下固定 15min，1×PBS洗3次，吸凈PBS。（3）通透：用0.1%滲透液Triton-100室溫下孵育15min，1×PBS洗3次，每次5min，吸凈PBS。（4）封閉：加入封閉液（5%BSA，以1×PBS稀釋）室溫封閉1h，吸去封閉液。（5）滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體：一抗：單克隆β III-tubulin抗體（Sigma公司），使用封閉液1∶100稀釋。在室溫下孵育2h。1×PBS洗3次。（6）滴加適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記抗體，2抗：羊抗鼠-FITC IgG 1∶100（Jackson Immuno Rsearch）在室溫下置于濕盒內(nèi)孵育45min，1×PBS洗3次。（7）用含有細(xì)胞核染色劑DAPI的封片液封片（Vector Laboratories，Inc.），自然晾干后在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下SPOT形態(tài)及CGNs生長

制備成的CSPG SPOT肉眼所見是淡紅色圓斑，大小1mm左右。由于SPOT含有德克薩斯熒光染料，在熒光顯微鏡下非常容易發(fā)現(xiàn)和辨認(rèn)，而視野的其他部分由于不發(fā)光，不能被看到。圖1A和B分別為CSPG SPOT在低倍鏡下所見。圖1C是在高倍鏡下看到的CGNs經(jīng)β III-tubulin染色后的形態(tài)以及與SPOT的關(guān)系，由于該SPOT沒有混合CSPG，CGNs可以在SPOT上生長，細(xì)胞的軸突也可以自由穿過CSPG/PLL界面任意地爬行生長，軸突生長方向不受限制。

2.2 顯微鏡下無染色細(xì)胞在CSPG SPOT上生長的觀察方法。

圖2A為熒光顯微鏡下所攝的圖片，紅色部分為SPOT，這是鏡下所見SPOT的實(shí)際染色。圖2B為在同一視野固定不動(dòng)的情況下，轉(zhuǎn)換為光鏡下所攝的圖片。圖2C為圖1A和B經(jīng)photoshop疊加形成，疊加后SPOT為淺綠色。以下所示各圖均是同一視野下光鏡下和熒光下所拍圖片的疊加，SPOT均為淺綠色。分析疊加后的圖片，可以在同一張圖片上即可看到SPOT又可看到細(xì)胞生長情況?？梢詼?zhǔn)確，清楚地研究SPOT上細(xì)胞生長情況以及SPOT抑制細(xì)胞生長及軸突延伸情況。

2.3 CSPG對(duì)SY5Y細(xì)胞生長的影響

SY5Y細(xì)胞是具有神經(jīng)元特性的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，首先研究不同濃度CSPG對(duì)SY5Y細(xì)胞生長的影響。如圖3所見，在沒有CSPG（0μg/ml）的條件下SY5Y細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)板的底部均勻生長（圖3A）。在添加CSPG的培養(yǎng)皿中，每個(gè)條件種植相同數(shù)量的細(xì)胞，雖然含0.5μg/ml和1.0μg/ml CSPG SPOT的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞密度變得較稀疏，但細(xì)胞的生長仍比較健康（圖3B，C）。但當(dāng)CSPG濃度增加至3μg/ml時(shí)，可見明顯的以CSPG SPOT邊緣為界限的CSPG SPOT區(qū)域內(nèi)細(xì)胞生長抑制（圖3D），沒有細(xì)胞生長。但SPOT周圍區(qū)域的細(xì)胞生長正常，細(xì)胞突起也不向SPOT內(nèi)伸展。隨著CSPG濃度的逐漸升高，CSPG周邊部的細(xì)胞也受影響，細(xì)胞遠(yuǎn)離CSPG SPOT生長（圖4E，F(xiàn)）。

2.4 CSPG對(duì)小鼠CGNs生長的影響

CSPG對(duì)原代神經(jīng)元小鼠CGNs的影響與對(duì)SY5Y細(xì)胞生長的影響相似，只是CSPG抑制細(xì)胞生長所需的濃度有所不同。如圖4所示，在沒有CSPG（0μg/ml）的條件下，CGNs在整個(gè)培養(yǎng)板的底部均勻生長（圖4A），0.5μg/ml CSPG使得CSPG SPOT區(qū)域的細(xì)胞生長密度略有降低（圖4B），當(dāng)CSPG濃度升為1.0μg/ml時(shí)，可見明顯的細(xì)胞生長停止的邊界：沿著CSPG SPOT的邊緣，CSPT SPOT內(nèi)細(xì)胞不生長，CSPG SOPT外細(xì)胞生長，但細(xì)胞突起不向SPOT內(nèi)伸展（圖4C）。但當(dāng)CSPG濃度升至3.0μg/ml時(shí)（圖4D），CSPT SPOT外緣周圍區(qū)域細(xì)胞生長也受到限制，這種限制在5.0和10.0μg/ml的濃度時(shí)更明顯（圖4E，F(xiàn)）。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)性膠質(zhì)增生或膠質(zhì)瘢痕形成。在膠質(zhì)瘢痕的形成過程中，膠質(zhì)細(xì)胞分泌一些抑制性分子，主要包括一些CSPGs，這些抑制分子在損傷區(qū)的堆積是抑制軸突生長的重要因素［10］。為了研究CSPG阻斷神經(jīng)元軸突生長的機(jī)制，我們制作CSPG SPOT模擬體內(nèi)神經(jīng)元損傷后病變區(qū)CSPG升高的病理生理環(huán)境。首先在細(xì)胞培養(yǎng)皿的底部覆蓋一層PLL，PLL是由多種細(xì)胞分泌的存在于細(xì)胞基質(zhì)中對(duì)細(xì)胞起著支持、保護(hù)、連結(jié)和營養(yǎng)作用的一種物質(zhì)，這個(gè)過程相當(dāng)于模擬神經(jīng)細(xì)胞正常生存的基質(zhì)環(huán)境。然后在其上加入5μl含有CSPG的液體，這個(gè)小液滴由于重力和張力作用形成大約直徑1mm的圓形區(qū)域，這個(gè)區(qū)域相當(dāng)于神經(jīng)損傷病變區(qū)，含有CSPG。由于CSPG液體本身沒有顏色，即使在顯微鏡下也不能確定這個(gè)模擬神經(jīng)病變區(qū)的位置所在。所以我們在配制CSPG的液體中加入無生物毒性的熒光染料。這樣我們就可以在熒光顯微鏡下區(qū)分病變區(qū)和非病變區(qū)，研究神經(jīng)生長與CSPG抑制作用之間的關(guān)系。CSPG和PLL的交界區(qū)，我們稱為CSPG/PLL界面，界面的一邊主要含有CSPG，界面的另一邊僅含有PLL。細(xì)胞的軸突如果能夠穿過這一區(qū)域，細(xì)胞就可以在CSPG上生長，即在病損區(qū)生長，是判定CSPG濃度是否抑制細(xì)胞生長的分界線。

我們發(fā)現(xiàn)在最低的4倍物鏡下可以看到整個(gè)5μl的液滴形成的SPOT，但無法觀察細(xì)胞生長情況。20倍物鏡下可以看到細(xì)胞生長被抑制的起止點(diǎn)，但無法細(xì)致地觀察細(xì)胞生長情況。在63倍的物鏡下，細(xì)胞體以及細(xì)胞軸突生長和生長方向非常清楚，有利于研究病變區(qū)細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況。

腫瘤細(xì)胞能夠自給自足地獲得生長信號(hào)，具有頑強(qiáng)的生長和分裂的能力。而原代神經(jīng)元培養(yǎng)所需的條件較高，對(duì)周圍環(huán)境改變極其敏感。所以我們分別選擇具有神經(jīng)元特性的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系—SY5Y和CGNs神經(jīng)元，研究抑制細(xì)胞生長的模型對(duì)他們的影響及發(fā)現(xiàn)抑制這兩種細(xì)胞生長的最適合濃度。我們發(fā)現(xiàn)引起細(xì)胞生長抑制的CSPG濃度在不同細(xì)胞中不同，如在SY5Y細(xì)胞中需要3μg/ml達(dá)到明顯的生長抑制，而在CGNs中僅需要1μg/ml。同時(shí)我們觀察到，小鼠CGNs對(duì)CSPG的變化更敏感，3μg/ml CSPG濃度可使SPOT周圍區(qū)域的細(xì)胞生長受到抑制，而在SY5Y細(xì)胞，直到5μg/ml的濃度，SPOT周圍區(qū)域細(xì)胞生長才開始受到抑制，10μg/ml對(duì)SPOT周圍的抑制更加明顯。這一結(jié)果提示，在具體的實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)根據(jù)所使用的細(xì)胞種類的不同選擇相應(yīng)的適宜濃度，甚至實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌珻SPG應(yīng)使用的濃度也會(huì)不同。以本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為例，如果研究某種治療方法對(duì)軸突生長的促進(jìn)作用，那么對(duì)于小鼠CGNs我們選擇1μg/ml，對(duì)SY5Y細(xì)胞我們選擇3μg/ml。這兩個(gè)濃度引起的細(xì)胞突起生長抑制剛好是沿著CSPG SPOT邊緣，而不累及SPOT周圍區(qū)域。如果使用藥物抵消CSPG的作用，細(xì)胞可能重新在SPOT上生長，軸突可能又延伸至CSPG SPOT內(nèi)，我們將在今后的研究中深入探討。

雖然CSPG引起神經(jīng)元突起生長抑制已比較肯定，但CSPG的作用機(jī)理還不明確，最近有報(bào)道Rho/ROCK通路可能參與了CSPGs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］，目前Rho/ROCK通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)與突起生長有關(guān)的骨架肌動(dòng)蛋白的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，許多軸突生長抑制分子都是通過激活該通路發(fā)揮效應(yīng)的。這提示在損傷局部直接降解CSPGs，或者抑制與CSPGs有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)于CNS損傷后的軸突再生都可能有促進(jìn)作用。利用本研究方法建立的模型，可以在原位通過免疫染色的方法，觀察細(xì)胞與CSPG接觸后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的變化，同時(shí)可以研究在針對(duì)CSPG給予相應(yīng)的處理?xiàng)l件后神經(jīng)元軸突的生長變化情況。所以這一模型對(duì)研究CNS損傷后神經(jīng)元軸突的生長和神經(jīng)元的再生具有廣泛的應(yīng)用前景。

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（編輯裘孝琦，英文編輯陳 姜）

An in vitro Model of Chondroitin Sulfate Proteoglycan-induced Axon Outgrowth Inhibition

TAN Fei，WU Xiao-li，JING Liang，LI Gui-chen，ZHAO Chen，GUO Yang
（Department of Neurology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo establish an in vitro model to study the inhibitory effect of chondroitin sulfate proteoglycan（CSPG）on neuronal growth and axonal regeneration.MethodsDifferent concentrations of CSPG were mixed with Texas-red Dye which has no biological toxicity，and 5μl of the mixture was dropped onto the center of the bottom of culture plates to form red round spots，which was called CSPG spots.SY5Y neuroblastoma cells or cerebellar granule neuron （CGN）from mice were seeded on the plates and cultured for 48hours.The cell growth and axon extension were observed under microscope.ResultsIn CSPG spots containing 1and 3μg/ml of CSPG，the growth of CGNs and SY5Y neuroblastoma cells were inhibited，and cell death occurred in the spot areas.No axon extension was found in cells outside the CSPG spots.High concentration of CSPG in the spots inhibited the growth of cells around CSPG spots.ConclusionThis model mimics the CSGP-induced axon outgrowth inhibition，which can be used to study the neuronal growth and axonal regeneration after central nervous system injury.

chondroitin sulfate proteoglycan；cell growth；axon extension；cerebellar granule neuron；neuroblastoma cell

R338.1

A

0258-4646（2011）01-0004-05

遼寧省科技廳社發(fā)基金資助項(xiàng)目（2009225010-12）

譚斐（1966-），男，副教授，碩士.E-mail：tanf@sj-hospital.org

2010-10-05