王露，趙玉巖，馬冬杰，田雷，鄭德祿，杜瑞伶

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110001）

增食欲素受體1在營養(yǎng)性肥胖大鼠腎上腺皮質(zhì)中的表達及意義

王露，趙玉巖，馬冬杰，田雷，鄭德祿，杜瑞伶

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110001）

目的探討營養(yǎng)性肥胖大鼠腎上腺皮質(zhì)組織中增食欲素受體1（OX1R）的表達規(guī)律，以及下丘腦增食欲素（orexin）系統(tǒng)對其調(diào)節(jié)作用。方法 高脂飲食誘導(dǎo)構(gòu)建并評估營養(yǎng)性肥胖大鼠動物模型；免疫組化法檢測腎上腺皮質(zhì)組織中OX1R的表達；側(cè)腦室注射orexin反義的硫代磷酸化-脫氧寡核苷酸（OX-PS-ODNs）干預(yù)下丘腦增食欲素系統(tǒng)，分析腎上腺皮質(zhì)中OX1R的變化規(guī)律。結(jié)果 大鼠高脂膳食飼養(yǎng)8周后，營養(yǎng)性肥胖組大鼠體質(zhì)量、體脂含量、Lee′s指數(shù)、血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇高于對照組（P<0.05）。OX1R的蛋白表達定位于大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞的細胞質(zhì)中；與正常對照組相比，營養(yǎng)性肥胖大鼠腎上腺皮質(zhì)中的OX1R的表達升高（P<0.05），且OX1R的表達量與Lee′s指數(shù)、血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇呈顯著負相關(guān)（r分別為-0.829，-0.710，-0.801，-0.733和-0.756）。OX-PS-ODNs干預(yù)下丘腦orexin系統(tǒng)2d后，營養(yǎng)性肥胖大鼠腎上腺皮質(zhì)中OX1R的表達明顯下降（P<0.05）。結(jié)論大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞的細胞質(zhì)中有OX1R的表達，營養(yǎng)性肥胖大鼠體內(nèi)orexin系統(tǒng)可能通過下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸參與調(diào)控能量代謝。

肥胖；增食欲素受體1；腎上腺皮質(zhì)；基因表達

增食欲素（orexin）是一種下丘腦神經(jīng)肽，包括orexin A和orexin B，通過激活G蛋白耦聯(lián)受體-orexin受體（orexin receptor，OXR）發(fā)揮作用。orexin系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)機體的攝食、能量代謝平衡、睡眠-覺醒等重要內(nèi)分泌代謝生理過程。但關(guān)于orexin系統(tǒng)對下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）的調(diào)控作用尚不清楚。本研究探討orexin系統(tǒng)中的重要成員——增食欲素受體1（orexin receptor 1，OX1R）在營養(yǎng)性肥胖大鼠腎上腺皮質(zhì)中的表達規(guī)律，闡明orexin系統(tǒng)在HPA中的作用以及調(diào)控能量代謝過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量160～180g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。針對orexin基因mRNA啟動區(qū)設(shè)計的反義、錯義脫氧寡核苷酸，由大連寶生物技術(shù)有限公司合成，末端硫代磷酸化保護修飾，制成反義的硫代磷酸化-脫氧寡核苷酸 （OX-PS-ODNs） 和錯義 OX-AS-ODNs。Orexin反義脫氧寡核苷酸序列為 5′CAGACTCCTTGGGTATTTG3′，錯義脫氧寡核苷酸序列為5′TGATCCAC CTAGCGTAATTG3′。高脂飼料參照Eun［1］的方法并加以改進。SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.2 下丘腦orexin系統(tǒng)干預(yù)實驗：30只肥胖大鼠隨機分為肥胖鹽水組（側(cè)腦室注射生理鹽水）、肥胖反義組（側(cè)腦室注射OX-PS-ODNs）和肥胖錯義組（側(cè)腦室注射OX-AS-ODNs）。大鼠給予10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔麻醉，參照大鼠腦冠狀面定位圖譜行右側(cè)腦室顱骨鉆孔，將導(dǎo)管垂直插入腦室，牙托粉固定，局部注射氨芐青霉素抗感染。插管1周后，OX-PS-ODNs、OX-AS-ODNs 10μl（5μg/μl）及等容積生理鹽水，每天3次，連續(xù)2d［4］。實驗結(jié)束后，大鼠麻醉下側(cè)腦室注射黑墨水（2μl/只）來驗證插管的位置。

1.2.3 生化測定：測定血清血糖（葡萄糖氧化酶法，美國LIFESCAN穩(wěn)步型血糖儀），血清胰島素（直接化學(xué)發(fā)光法，美國SLEMENS），甘油三酯、總膽固醇（生化酶法，日本Determiner-C TG/TC）。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色法：取大鼠腎上腺于10%福爾馬林中固定，經(jīng)脫水、透明后包埋為蠟塊，每個蠟塊各切為4μm的組織切片，SABC法免疫組化染色分析OX1R蛋白的相對表達水平。免疫陽性胞質(zhì)著色為棕黃色。免疫組化結(jié)果用顯微鏡數(shù)碼成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS BX51）進行拍照，用Imageproplus 5.0軟件進行量化分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高脂膳食誘導(dǎo)大鼠營養(yǎng)性肥胖

大鼠高脂膳食飼養(yǎng)8周后，高脂肥胖組大鼠體質(zhì)量、Lee′s指數(shù)、體脂含量、血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇分別高于對照組25.7%、2.9%、19.2%、30.0%、41.0%、63.9%、38.4%（P<0.05）（表 1），提示高脂膳食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生營養(yǎng)性肥胖，大鼠體內(nèi)出現(xiàn)脂代謝紊亂。

表1高脂膳食對大鼠體質(zhì)代謝的影響（±s）T a b.1T h e e f f e c t o f h i g h-f a t d i e t t o r a t me t a b o l i s m（±s）Body weight Lee′s index Body fat contents Blood glucose Insulin Triglycerides Ttotal cholesterol（g） （kg/m2） （%） （mmol/L） （mIU/L） （mmol/L） （mmol/L）Normal group 10 352.44±14.52 297.53±3.42 2.39±0.06 6.94±0.78 11.19±1.28 0.86±0.13 1.64±0.13Obese group 10 442.93±13.591） 306.32±2.151） 2.85±0.131） 9.02±0.911） 5.78±3.421） 1.41±0.121） 2.27±0.731）1）P ＜0.05vs normal group.Group n

2.2 營養(yǎng)性肥胖大鼠腎上腺皮質(zhì)中OX1R的表達

免疫組織化學(xué)染色法分析結(jié)果顯示：大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞可以表達OX1R蛋白；營養(yǎng)性肥胖組大鼠腎上腺皮質(zhì)OX1R的表達量（OD值為30.50±1.16）比對照組（OD 值為 22.89±2.71）高出30.4%，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.3 側(cè)腦室干預(yù)實驗影響營養(yǎng)性肥胖大鼠腎上腺皮質(zhì)中OX1R的表達

營養(yǎng)性肥胖大鼠側(cè)腦室給予OX-PS-ODNs、OXAS-ODNs和生理鹽水2d后，反義組大鼠腎上腺皮質(zhì)OX1R表達量（OD值為15.78±2.85）較錯義組（OD值為28.76±2.11）低44.5%、較鹽水組（OD值為30.48±1.70）低48.6%，反義組與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

3 討論

早期研究發(fā)現(xiàn)，表達于下丘腦組織的orexin系統(tǒng)能參與調(diào)節(jié)機體能量平衡、攝食、睡眠等作用，側(cè)腦室注射orexin A可以使多種實驗動物攝食增加，從而與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)［1，4］。也有研究指出，orexin在肥胖及胰島素抵抗大鼠模型中表達降低，提示orexin可能不是肥胖發(fā)生的原因，而是對肥胖發(fā)生產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)作用［4］。本研究結(jié)果顯示，高脂膳食能誘導(dǎo)肥胖大鼠模型建立，而且體質(zhì)量、Lee′s指數(shù)、體脂含量、血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇等指標(biāo)分別高于對照組。在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)，該類模型大鼠下丘腦中orexin的表達降低，OX1R的表達增多，提示orexin敏感性增加可能是肥胖發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)［6］。此外，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠體脂代謝也發(fā)生了變化，這與人類單純性肥胖的自然發(fā)生過程相似，有利于單純性肥胖發(fā)病機制的研究。

最近的研究顯示，orexin及其功能性受體也存在于周圍系統(tǒng)，還能調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌軸，如HPA軸［6］。因此，orexin可以作為一個循環(huán)激素和（或）自分泌旁分泌物質(zhì)起作用。orexin系統(tǒng)能調(diào)節(jié)HPA軸，促進醛固酮、糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺的分泌及腎上腺皮質(zhì)細胞的生長等［6］。側(cè)腦室注射orexin能激活大鼠室旁核神經(jīng)元，還能升高血中促腎上腺皮質(zhì)激素及皮質(zhì)酮水平，orexin還能通過OX1R耦聯(lián)蛋白激酶C通路來刺激牛腎上腺髓質(zhì)合成兒茶酚胺，OX1R可以負性耦聯(lián)腺苷酸環(huán)化酶依賴級聯(lián)來刺激豬腎上腺髓質(zhì)分泌兒茶酚胺［7,8］。本研究中，肥胖大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞的細胞質(zhì)中有OX1R的表達，且表達量較正常對照組增高。通過給予肥胖大鼠側(cè)腦室插管并注射OX-PS-ODNs作為干預(yù)因素，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，反義組大鼠腎上腺皮質(zhì)OX1R表達量較其他兩組降低，說明OX-PS-ODNs能特異性阻斷下丘腦orexin的表達，orexin作為一種循環(huán)激素，到達外周腎上腺組織的orexin相應(yīng)減少，腎上腺皮質(zhì)OX1R表達也相應(yīng)減少，提示著orexin對腎上腺激素的刺激作用降低。由于上述腎上腺激素促進動物新陳代謝及能量消耗，因此對該類激素的抑制會導(dǎo)致動物體質(zhì)量增加。實驗動物中樞orexin減少對動物攝食的抑制，部分被外周腎上腺激素的變化抵消，若要達到有效減輕體質(zhì)量的作用，需在外周對腎上腺軸中orexin及其受體進行干預(yù)。這一結(jié)論為中樞及外周調(diào)控體質(zhì)量藥物的研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

［1］Eun SP，Seong JY，Jin SK，et al.Changes in orexin-A and neuropeptide Y expression in the hypothalamus of the fasted and high-fat diet fed rats［J］.Veterinary Science，2004，5（4）：295-302.

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［3］Tang-Christensen M，Kristensen P，Stidsen CE，et al.Central administration of Y5receptor antisense decreases spontaneous food intake and attenuates feeding in response to exogenous neuropeptide Y［J］.Endocrinology，1998，159（2）：307-312.

［4］劉禮斌，廖麗萍，陳洲，等.肥胖大鼠前增食欲素原及增食欲素受體基因表達與下丘腦-垂體-腎上腺軸有關(guān)［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2007，23（5）：452-453.

［5］趙玉巖，郭磊，都健，等.高果糖膳食對大鼠下丘腦增食欲素系統(tǒng)的影響［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2004，20（1）：82-83.

［6］Spinazzi R，Gastone G，Paola G，et al.Orexins in the regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis ［J］.Pharmacol Rev，2006，58（1）：46-57.

［7］Ziolkowska A，Spinazzi R，Albertin G，et al.Orexins stimulate glucocorticoid secretion from cultured rat and human adrenocortical cells，exclusively acting via the OX1receptor［J］.Steroid Biochem Mol Biol，2005，96（5）：423-429.

［8］SpinazziR，RucinskiM，MalendowiczLK，etal.Preproorexinand orexin receptors are expressed in cortisol-secreting adrenocortical adenomas，and orexins stimulate in vitro cortisol secretion and growth of tumor cells［J］.Clin Endocrinol Metab，2005，90（6）：3544-3549.

（編輯武玉欣，英文編輯鄭華川）

Expression and Significance of Orexin Receptor 1in the Adrenal Cortex of Diet-induced Obese Rats

WANG Lu，ZHAO Yu-yan，MA Dong-jie，TIAN Lei，ZHENG De-lu，DU Rui-ling
（Department of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo observe the expression of orexin receptor 1（OX1R）in dietary obese rats，and to investigate the regulatory effects of hypothalamus orexin system on OX1R.MethodsThe diet-induced obese rat models were established and evaluated by feeding a highfat diet for 8weeks.Immunohistochemistry was employed to examine the expression of OX1R in adrenal cortex of rats.Lateral ventricular canalization was performed in obese rats，which then

an intra-cerebroventricular injection of OX antisense oligodeoxynucleotide（OX1R-PS-ODNs），in order to intervene hypothalamus orexin system，and to analyze the variation of OX1R.ResultsThere were statistical differences in weight，body fat contents，Lee′s index，blood glucose，insulin，triglycerides and total cholesterol between the high-fat diet group and the control group after 8weeks （P<0.05）.The OX1R protein appeared in adrenal cortex zona glomerulosa.The expression of OX1R was obviously increased in adrenal cortex of high-fat diet rats（P<0.05），and negatively correlated with Lee′s index，blood glucose，insulin，triglycerides and total cholesterol （P<0.05）.The correlation coefficient was-0.829，-0.710，-0.801，-0.733and-0.756respectively.The amount of OX1R in adrenal cortex of high-fat diet rats was significantly decreased after 2days of intra-cerebroventricular injection of OX-PSODN.ConclusionThe expression of OX1R is observed in zona glomerulosa cytoplasm of rat adrenal cortex.Orexin system might be involved in the regulation of modelate-energy metabolism via hypothalamic-pituitary-adrenal（HPA）axis in dietary obese rats.

obese；orexin receptor 1；adrenal cortex；gene expression

R586.9

A

0258-4646（2011）01-0001-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（30872724）；遼寧省自然科學(xué)基金資助項目（20082116）；遼寧省科技攻關(guān)層次計劃項目（2008225009；2009225010-3）

王露（1985-），女，碩士研究生.

趙玉巖，E-mail：G572@sina.com

2010-10-13