何 靜 丁穎 彭俊宇 李芬 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 長(zhǎng)沙 408湖南桃源三尖農(nóng)牧有限責(zé)任公司 湖南桃源 45700)

火雞組織滴蟲(chóng)體外微量培養(yǎng)方法的改進(jìn)

何 靜1丁穎1彭俊宇2李芬1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 長(zhǎng)沙 4101282湖南桃源三尖農(nóng)牧有限責(zé)任公司 湖南桃源 415700)

本研究通過(guò)改進(jìn)火雞組織滴蟲(chóng)在M199培養(yǎng)液中的體外微量培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步研究其診斷、生活史及致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。通過(guò)將人工體外培養(yǎng)的組織滴蟲(chóng)在顯微鏡下反復(fù)檢查、稀釋后用毛細(xì)吸管吸取單個(gè)蟲(chóng)體至1.5mL的離心管中，于40℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并用鏡檢和PCR技術(shù)檢查蟲(chóng)體是否增殖。結(jié)果顯示有2個(gè)離心管有蟲(chóng)體增殖。

組織滴蟲(chóng) 微量培養(yǎng) PCR火雞組織滴蟲(chóng)（Histomonas meleagridis）是一種能引起雞形目禽類(lèi)盲腸和肝臟損傷及機(jī)能紊亂的單鞭毛寄生性原蟲(chóng)[1]。在最近的幾十年間，組織滴蟲(chóng)病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重危害。通過(guò)人工模擬宿主的體內(nèi)環(huán)境條件,使蟲(chóng)體在宿主體外完成其寄生階段生長(zhǎng)發(fā)育[2]，這種方法可以解決火雞組織滴蟲(chóng)研究過(guò)程中缺乏所需的蟲(chóng)體材料的問(wèn)題。到目前為止，已有許多學(xué)者成功進(jìn)行了組織滴蟲(chóng)的體外培養(yǎng)[3-8]，但這些培養(yǎng)方法都不能獲得純的組織滴蟲(chóng)，其培養(yǎng)基中除含有組織滴蟲(chóng)外還含有細(xì)菌等許多雜質(zhì)。本文在總結(jié)前人體外微量培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化分離取材、純化及擴(kuò)增的方法，獲得了純的組織滴蟲(chóng)，為組織滴蟲(chóng)病的進(jìn)一步研究準(zhǔn)備了良好的材料，并豐富了火雞組織滴蟲(chóng)體外培養(yǎng)的研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)種：本實(shí)驗(yàn)所用的組織滴蟲(chóng)蟲(chóng)體培養(yǎng)的病料來(lái)自于用胚胎化的異刺線蟲(chóng)蟲(chóng)卵人工感染火雞，使火雞發(fā)生組織滴蟲(chóng)病，將發(fā)病火雞的盲腸內(nèi)容物進(jìn)行體外培養(yǎng)所得。

1.1.2 主要試劑：M-199培養(yǎng)基粉、Taq酶（大連寶生物公司產(chǎn)品），蛋白酶K（Merck公司產(chǎn)品），WizardTMDNAClean-up System（Promega公司產(chǎn)品），PCR試劑（Buffer、MgCl2、dNTPs）為大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 M-199培養(yǎng)液的配備：用于組織滴蟲(chóng)體外培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液是用購(gòu)買(mǎi)了GIBCO公司原裝M-199培養(yǎng)基粉末，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，4℃保存?zhèn)溆?。使用培養(yǎng)液時(shí)，用滅菌吸量管吸取9mL的M-199培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，另外再加入11mg滅菌米粉和15%的胎牛血清。

1.2.2 火雞組織滴蟲(chóng)體外微量培養(yǎng)：在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入9mL M-199培養(yǎng)液，其中含有無(wú)機(jī)鹽、L－谷氨酰胺、25mMHEPES和L-氨基酸，另外再加入11mg滅菌米粉和15%的胎牛血清。將處于瀕死期患組織滴蟲(chóng)病的火雞肝臟和盲腸放在40℃恒溫水浴鍋上，用滅菌的剪刀將盲腸剪開(kāi)，把所有盲腸內(nèi)容物全部放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入40℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用滅菌吸管吸取一滴培養(yǎng)液在載玻片上，馬上蓋上蓋玻片，放在10×40倍顯微鏡下進(jìn)行檢查。如果發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似組織滴蟲(chóng)的蟲(chóng)體在其中活動(dòng)，用吸量管專(zhuān)用鉗子將硼酸硅毛細(xì)吸管拉細(xì)，使其外徑縮小至2.5mm，制成玻璃微量吸管。將微量吸管靜止固定在顯微鏡上，其玻璃吸管與1個(gè)一端帶有空注射器的軟管相連接，并由其抽吸而成形。將含有組織滴蟲(chóng)的培養(yǎng)液

與新鮮的培養(yǎng)液按1∶100的比例稀釋?zhuān)詫?shí)現(xiàn)培養(yǎng)液視野中可以清晰地看見(jiàn)單個(gè)蟲(chóng)體。將100μL培養(yǎng)液隨機(jī)滴數(shù)滴至載玻片上，以挑選單個(gè)蟲(chóng)體。用吸管吸取1滴載玻片上的培養(yǎng)液移至微量離心管中。整個(gè)過(guò)程用顯微鏡400倍放大進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確保每次只有1個(gè)蟲(chóng)體細(xì)胞被轉(zhuǎn)移。分離后將微量離心管中加入1mL新鮮的M-199培養(yǎng)液，移至40℃培養(yǎng)4d。在第2、3、4d用光學(xué)顯微鏡監(jiān)測(cè)蟲(chóng)體的生長(zhǎng)情況。連續(xù)做平行的10個(gè)離心管，每天觀察并記錄每個(gè)離心管中組織滴蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況，每隔2天轉(zhuǎn)種1次。通過(guò)E.Grabensteiner[9]等報(bào)道按照基因庫(kù)中發(fā)布的序列號(hào)為AF293056的序列合成特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。將所有的陽(yáng)性樣品繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 組織滴蟲(chóng)體外培養(yǎng)

將處于瀕死期的疑似患組織滴蟲(chóng)病的火雞肝臟或盲腸內(nèi)容物放入新鮮的M-199培養(yǎng)液中，在40℃的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)48h后，在10×40倍顯微鏡下觀察，可看到視野中有許多呈空泡狀，大小約為5～30μm，形狀不斷變化，類(lèi)似組織滴蟲(chóng)的蟲(chóng)體在視野內(nèi)不斷地進(jìn)行鐘擺狀運(yùn)動(dòng)。

2.2 組織滴蟲(chóng)微量培養(yǎng)

將含有組織滴蟲(chóng)的培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行反復(fù)稀釋后，直到在顯微鏡視野中看到1個(gè)蟲(chóng)體為止。然后用拉細(xì)的毛細(xì)吸管將這1個(gè)蟲(chóng)體吸入已加入1mL配制好的M-199培養(yǎng)液的1.5mL的離心管中，放到40℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察并記錄組織滴蟲(chóng)在離心管中的生長(zhǎng)情況，每隔2天轉(zhuǎn)種1次。培養(yǎng)48h后觀察發(fā)現(xiàn)，只在其中的2個(gè)離心管中發(fā)現(xiàn)有組織滴蟲(chóng)增殖，其余8管中未看見(jiàn)有任何蟲(chóng)體在其中活動(dòng)，詳請(qǐng)見(jiàn)表1。

2.3 火雞組織滴蟲(chóng)微量培養(yǎng)液用于PCR檢測(cè)

分別從10個(gè)進(jìn)行微量培養(yǎng)的離心管中吸取200μL培養(yǎng)液進(jìn)行消化后提取DNA，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1。

3 討論

微量培養(yǎng)能夠彌補(bǔ)采用一般的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液中除含有所需要的有機(jī)體外還含有許多其他雜質(zhì)的不足。早在1978年Farri[10]就通過(guò)微量培養(yǎng)法成功地分離培養(yǎng)出溶血性阿米巴原蟲(chóng)，Oduola[11]等于1988年也采用微量培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出瘧原蟲(chóng)，緊接著B(niǎo)ushek[12]等獲得了伯金斯蟲(chóng)單蟲(chóng)體分離及微量培養(yǎng)技術(shù)的成功。但組織滴蟲(chóng)的微量培養(yǎng)經(jīng)歷了一個(gè)比較長(zhǎng)的探索過(guò)程，直到2006年M.HESS[13-14]等才首次成功通過(guò)用含有組織滴蟲(chóng)的M-199培養(yǎng)液反復(fù)稀釋后，用拉細(xì)的毛細(xì)吸管在顯微操作臺(tái)上成功地分離出單個(gè)的組織滴蟲(chóng)并且感染試驗(yàn)動(dòng)物成功，隨后陸續(xù)有學(xué)者進(jìn)行了組織滴蟲(chóng)的微量培養(yǎng)[15-16]。

表1 火雞組織滴蟲(chóng)微量培養(yǎng)結(jié)果

圖1 組織滴蟲(chóng)微量培養(yǎng)樣品PCR產(chǎn)物電泳圖

本次試驗(yàn)在顯微鏡下用毛細(xì)吸管共分離出10株組織滴蟲(chóng)，通過(guò)顯微鏡檢查和PCR技術(shù)鑒定后發(fā)現(xiàn)，只有2個(gè)離心管中的蟲(chóng)體正常增殖，成功率只有20%。這次組織滴蟲(chóng)微量培養(yǎng)成功率很低的原因，一方面是由于組織滴蟲(chóng)本身對(duì)外界環(huán)境的抵抗力很弱，并且其體外沒(méi)有任何囊膜對(duì)其進(jìn)行保護(hù)，還可能由于水分喪失而死亡，因此存活在外界環(huán)境中的蟲(chóng)體非常有限；另一方面，在進(jìn)行蟲(chóng)體分離過(guò)程中死亡或者粘在吸管壁上面而沒(méi)有被轉(zhuǎn)移至離心管中，也可能是由于蟲(chóng)體抵抗力太弱，單個(gè)的蟲(chóng)體在培養(yǎng)液中很難生長(zhǎng)。因此，筆者建議在進(jìn)行顯微操作分離蟲(chóng)體時(shí)為蟲(chóng)體創(chuàng)造一個(gè)適宜其生存的環(huán)境。本次通過(guò)PCR方法對(duì)微量培養(yǎng)材料進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果與顯微鏡觀察結(jié)果完全一致。國(guó)外已有M.HESS[14]和E.Grabensteiner[15]等通過(guò)設(shè)計(jì)不同的引物，直接從培養(yǎng)液中成功擴(kuò)增出組織滴蟲(chóng)的基因，并與雞四毛滴蟲(chóng)和酵母菌相區(qū)別。

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S832

A

1008-3847(2011)04-0002-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（NO.30771616）和湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)2010年大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（YCX1025）資助。

翁亞彪