莊志偉 郝建華 孫 謐 (山東六和集團(tuán) 山東青島6606山東省青島黃海水產(chǎn)研究所酶與酶工程實(shí)驗(yàn)室 山東青島66000)

海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)發(fā)育的影響

莊志偉1郝建華2孫 謐2(1山東六和集團(tuán) 山東青島2660612山東省青島黃海水產(chǎn)研究所酶與酶工程實(shí)驗(yàn)室 山東青島266000)

海洋低溫蛋白酶 對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)發(fā)育的影響

隨著生活水平的提高，特別是自1999年比利時(shí)二惡英事件和英國(guó)瘋牛病事件以來，人們?cè)桨l(fā)關(guān)注由于抗生素濫用、亂用而引起的人畜健康問題，對(duì)畜產(chǎn)品安全性的呼聲越來越高，環(huán)保意識(shí)也逐步加強(qiáng)。積極開發(fā)新的飼料資源，提高飼料的轉(zhuǎn)化效率，降低飼料成本，促進(jìn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，已成為畜牧界亟待解決的問題。飼料添加劑多種多樣，飼用酶制劑具有高度特異性和催化效率高、安全無毒害等優(yōu)點(diǎn)，添加蛋白酶能補(bǔ)充動(dòng)物體內(nèi)源酶的不足，消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，可顯著提高飼料的利用率，擴(kuò)大可利用飼料資源范圍，降低養(yǎng)殖成本，改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境。酶制劑在飼料工業(yè)中的有效應(yīng)用，使得飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)安全、高效、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展成為可能。

海洋低溫蛋白酶MP來自海洋細(xì)菌YS-80-122，經(jīng)對(duì)該蛋白酶分離純化，SDS-PAGE顯示該蛋白酶分子量大約為46KD。其最適作用溫度為30℃，最適pH為10.4，屬于低溫堿性蛋白酶。本文就海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能、免疫力的影響進(jìn)行探討，為該酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海洋低溫蛋白酶MP由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供。試驗(yàn)用飼料及雞只由山東六和集團(tuán)提供。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

96孔V型微量血凝板、微型振蕩器、塑料離心管、50μL移液器、DS-671電子秤、奧立龍酸度計(jì)、恒溫箱。稀釋液為氯化鈉（GB1266-77）177g，磷酸二氫鉀（GB1274-77）13.6g，氫氧化鈉（GB629-77）3.0g，蒸餾水1000mL，高壓滅菌，4℃保存，使用時(shí)作20倍稀釋。

1.3 試驗(yàn)日糧及營(yíng)養(yǎng)水平

見表1。

1.4 試驗(yàn)雞免疫程序

見表2。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.5.1 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

試驗(yàn)雞采用1d ROSS308雛雞720只，公母混合雛，按飼養(yǎng)試驗(yàn)要求均分為4個(gè)處理，公母各半，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60只。4個(gè)處理組添加不同劑量的海洋低溫蛋白酶MP，見表3。自由采食、飲水飼養(yǎng)至35d。記錄日耗料、日增重、料肉比、平均體重和成活率。

1.5.2 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞體重影響

試驗(yàn)雞采用1d ROSS308雛雞640只，進(jìn)行集中育雛，預(yù)試7天，按飼養(yǎng)試驗(yàn)要求隨機(jī)均分為對(duì)照組、試驗(yàn)組，每組320只，設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)80只，稱個(gè)體重各組間無差異（P＞0.05）。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組則在基礎(chǔ)日糧上添加500×10-6海洋低溫蛋白酶MP，自由采食、飲水飼養(yǎng)至42日齡，試驗(yàn)期為35d。分別在2、4、6周末8∶00稱取各組雞30只體重并記錄。1.5.3海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞NDHI效價(jià)的影響

表1日糧配方與營(yíng)養(yǎng)水平

表2 肉仔雞免疫程序

表3日糧設(shè)計(jì)方案

1.5.2 飼養(yǎng)至42d對(duì)試驗(yàn)雞只各組取30只，用1mL一次性注射器抽出翼靜脈約0.5mL血入塑料離心管，待凝固析出血清后以1000r/min離心5min做ND HI常規(guī)試驗(yàn)。

1.5.4 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞免疫器官的影響

1.5.2 飼養(yǎng)至42d試驗(yàn)結(jié)束后將各組試驗(yàn)雞只稱重后處死，剖檢，取出全部的脾臟、胸腺及法氏囊，用濾紙吸取表面的水分與血液后稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。NDHI檢測(cè)同1.5.2。

免疫器官指數(shù)（g/g）=免疫器官重量/試驗(yàn)雞只重量

1.5.5 雞腸道乳酸桿菌數(shù)量的測(cè)定

1.5.5.1 采樣及樣品稀釋

在21、35、42d分別從各處理重復(fù)中隨機(jī)抽取公母雞各2只稱重后經(jīng)口腔放血將雞處死，5%新潔爾滅消毒液浸泡全身5min，無菌剖開腹腔，將回盲結(jié)合處上和盲腸中部各5cm分別接扎，無菌取腸內(nèi)容物少許，將樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品25g加入盛有225mL無菌水的三角瓶里，在微型振蕩器上充分振搖，使樣品均勻分散，吸取5mL懸液即為10-1的樣品稀釋液，另取滅菌小試管若干，每支加入稀釋液4.5mL，取10-1的稀釋液0.5mL加入第二管10-2，以此類推做遞減稀釋，終稀釋度為10-11。

1.5.5.2 乳酸桿菌

選擇10-3～10-5的稀釋度，取100μL滴于MRS培養(yǎng)基平皿，用涂布棒涂布均勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣。將培養(yǎng)皿置于37℃生化厭氧箱中培養(yǎng)36h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

按下面公式計(jì)算每克內(nèi)容物中乳酸桿菌的數(shù)量。每克腸內(nèi)容物乳桿菌=3滴菌落數(shù)之和/3×滴數(shù)×稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每克內(nèi)容物乳酸菌，計(jì)算出n log10的均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA ONE-WAY過程進(jìn)行單因素的方差分析，LSD式多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

從表4可以看出，日糧中加入中高劑量海洋低溫蛋白酶MP明顯提高肉仔雞生產(chǎn)性能。

2.2 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞體重的影響

從表5可以看出，試驗(yàn)組2周時(shí)差異不顯著（P＞0.05），4周時(shí)則提高3.85%,差異顯著（P＜0.05），6周時(shí)則提高 3.63%，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞NDHI效價(jià)的影響

從表6可以看出，試驗(yàn)組與對(duì)照組ND HI抗體效價(jià)無差異（P＞0.05）。

2.4 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞只均耗料量、料肉比的影響

從表7可以看出，頭1周、第2周以及3～6周只均耗料試驗(yàn)組與對(duì)照組間均無差異（P＞0.05）；成活率也差異不顯著（P＞0.05）；而料肉比提高2.65%，差異顯著（P＜0.05）。

2.5 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

從表8可看出，試驗(yàn)組比對(duì)照組脾臟指數(shù)21d提高1.88%，差異顯著（P＞0.05）；35d則為2.2%，差異顯著（P＞0.05）；42d則為1.91%，差異顯著（P＞0.05）。而胸腺指數(shù)21d提高5.5%，差異極顯著（P＜0.01）；35d則 2.51%，差異顯著 （P＞0.05）；42d則7.06%，差異極顯著（P＜0.01）。法氏囊指數(shù)兩者間差異不顯著（P＞0.05）。

表4 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)35d肉仔雞生產(chǎn)性能的影響

表5 各組試驗(yàn)雞只均體重

表7 各組試驗(yàn)雞只均耗料量和飼料增重比

表8 肉仔雞免疫器官指數(shù)

表9 肉仔雞腸道中乳酸桿菌的數(shù)量

2.6 海洋低溫蛋白酶MP對(duì)腸道乳酸桿菌數(shù)量的影響

從表9可以看出，試驗(yàn)組與對(duì)照組在21d乳酸桿菌的數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）；35d則差異顯著（P＜0.05）；42d則差異不顯著（P＞0.05）；只有處理2與其差異顯著（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

通過本試驗(yàn)，可以看出，海洋低溫蛋白酶MP能提高肉仔雞的體重3.53%，飼料轉(zhuǎn)化率2.66%。機(jī)體免疫力與抵抗力方面，脾臟指數(shù)提高2%，胸腺指數(shù)提高4.8%，法氏囊指數(shù)變化不大，具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

試驗(yàn)組與對(duì)照組新城疫HI抗體水平無差異而言，與測(cè)定的法氏囊指數(shù)兩者間無差異相統(tǒng)一，因?yàn)榉ㄊ夏抑饕獏⑴c機(jī)體的體液免疫，這與免疫學(xué)是一致的。對(duì)于不同酶源而言，對(duì)不同的原料底物、動(dòng)物品種及不同生理階段，其潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不同，因此，應(yīng)進(jìn)一步研究不同畜禽飼料中添加酶制劑的最佳種類和添加量，確定酶制劑的營(yíng)養(yǎng)當(dāng)量，建立體外酶活性和實(shí)際添加效果間的模型，從而充分地應(yīng)用酶制劑的潛力，達(dá)到降低生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益及節(jié)約飼料資源的目的。

當(dāng)今世上是發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)和加強(qiáng)環(huán)保工作，減輕畜牧生產(chǎn)對(duì)環(huán)境污染的現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)是以大規(guī)模集約化生產(chǎn)為基本特征的，對(duì)環(huán)境的污染日趨嚴(yán)重，如氮、磷造成的水體富營(yíng)養(yǎng)化問題，中國(guó)的養(yǎng)殖污染在環(huán)保問題上占有很大的比重。在飼料中添加酶制劑，如蛋白酶和植酸酶等，可以降低養(yǎng)殖中氮、磷和其他元素的排泄量，有利于環(huán)境保護(hù)。

蛋白酶可以改善飼料利用率，又提高畜禽生產(chǎn)性能。飼用酶制劑可以在動(dòng)物的消化道內(nèi)，將飼料中的大分子物質(zhì)水解為易吸收的小分子物質(zhì)，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在糞便中的排出量，即對(duì)內(nèi)源酶起輔助補(bǔ)充作用。在幼齡動(dòng)物消化酶發(fā)育不完善，年老動(dòng)物消化酶分泌能力降低以及受到應(yīng)激或疾病感染后的動(dòng)物引起消化酶分泌紊亂等情況下，外源消化酶可補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足，增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)飼料養(yǎng)分的消化吸收能力，從而提畜禽產(chǎn)的生產(chǎn)力和飼料轉(zhuǎn)化效率。Bedford和Pack的研究表明，含有淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶的復(fù)合酶對(duì)玉米-豆粕型日糧營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有一定作用，可提高其中玉米的可利用能3%～5%。腸道中的乳酸桿菌的數(shù)量在35d時(shí)有所增加，而42d則差異不顯著，該酶能降低雞腸道內(nèi)提高乳酸桿菌的數(shù)量，而相應(yīng)抑制大腸桿菌的數(shù)量，35日齡雞的腸道桿菌數(shù)量明顯高于對(duì)照組，說明海洋低溫蛋白酶能夠有效調(diào)節(jié)雞腸道內(nèi)大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，使之達(dá)到平衡。酶制劑的應(yīng)用已經(jīng)引起養(yǎng)殖業(yè)和工業(yè)企業(yè)的高度重視，尤其現(xiàn)在的低碳環(huán)保經(jīng)濟(jì)，可以作為環(huán)保型飼料添加劑。

S831.4

A

1008-3847(2011)06-0002-04

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA091602)資助

莊志偉（1968-），男，博士研究生，主要從事畜禽養(yǎng)殖和海洋產(chǎn)物資源與酶工程研究。Email：zzw19680@163.com

* 通訊作者：孫 謐（1962-），研究員。Email∶sumi@ysfri.ac.cn，Tel∶(0532)85833961

董澤敏