張彬彬 邵慧君 王彥紅 劉文博（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇揚(yáng)州） 225009

1株多重耐藥性鴿源大腸桿菌的分離與鑒定

張彬彬 邵慧君 王彥紅 劉文博（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇揚(yáng)州） 225009

大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)感染包括急性敗血癥、肉芽腫、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、臍炎、腦炎、氣囊病以及其他部分或全部由大腸桿菌引起的疾病[1，2]。經(jīng)研究表明本病在世界各地均有發(fā)生，50%以上的菌株有多重耐藥性，該病是比較常見的人畜共患病，但是往往被人們所忽視[3]。鴿的大腸桿菌病也是鴿子養(yǎng)殖過程中常見的細(xì)菌病，并且鴿是大腸桿菌的一個天然儲存宿主[1]。本病一年四季均可發(fā)生，尤以冬季和夏季最為常見，病鴿是造成該病最主要的傳染源。大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性[2]，在選藥治療時存在一定的盲目性。筆者在臨床上分離了1株鴿大腸桿菌，并測定了其對16種抗菌藥的敏感性。

1 材料與方法

1.1 病料來源

無錫某養(yǎng)殖場共飼養(yǎng)了1000羽1年齡期的美國王鴿，正常免疫接種鴿瘟疫苗與禽流感疫苗，2010年7月鴿突然死亡，每天5～10只，部分鴿采食量下降，慶大霉素及丁胺卡那霉素（阿米卡星）飲水不見好轉(zhuǎn)，持續(xù)10天，遂送5只病死鴿來我院診斷。病理解剖后發(fā)現(xiàn)死亡的鴿腎臟充血，部分有蒼白色壞死點(diǎn)；肝臟腫大充血，部分呈土黃色；胰臟出現(xiàn)充血，腸道有積液，且鼻腔也出現(xiàn)黏液。

1.2 試驗(yàn)材料

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，按通用的組方自行配制。其中麥康凱瓊脂粉為上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品，瓊脂粉與氯化鈉為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，蛋白胨與胰酶為OXOID公司產(chǎn)品。

染色液：革蘭氏染色液。

生化發(fā)酵管：生化反應(yīng)管為上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所試劑廠產(chǎn)品，計(jì)14種。

藥敏試紙片：杭州天和微生物公司生產(chǎn)，計(jì)16種。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌操作從病死的鴿肝臟取樣，接種于LB平板，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后觀察菌落特征，待典型菌落出現(xiàn)后，再挑取典型菌落接種到麥康凱培養(yǎng)基上同樣置溫箱培養(yǎng)24h備用。

1.3.2 細(xì)菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：從純培養(yǎng)的麥康凱瓊脂平皿上挑取菌落制成涂片，作革蘭氏染色，然后在高倍油鏡

張彬彬 邵慧君 王彥紅 劉文博下觀察。

生化鑒定：按常規(guī)方法進(jìn)行。將所獲得分離菌的純培養(yǎng)菌落1～2個，分別接種于各種微量生化發(fā)酵管內(nèi)，置37℃溫箱培養(yǎng)24～48h，定時檢查反應(yīng)結(jié)果。

1.3.3 藥物敏感性試驗(yàn)

用接種環(huán)挑取單個菌落涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，再放藥敏紙片，置37℃溫箱培養(yǎng)18h。觀察測量抑菌圈的大小并記錄結(jié)果。此次選用16種抗菌藥物：鏈霉素（30μg）、復(fù)方新諾明（23.7/1.25μg）、慶大霉素（10μg）、氯霉素（30μg）、呋喃妥因（300μg）、美洛西林 （75μg）、萘啶酸 （30μg）、氟羅沙星（5μg）、羧芐青霉素（100μg）、卡那霉素（30μg）、四環(huán)素（30μg）、左氟沙星（5μg）、恩諾沙星（5μg）、阿米卡星（30μg）、頭孢西?。?0μg）和頭孢噻肟（30μg）。藥物敏感性的判定標(biāo)準(zhǔn)采用中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 病毒分離

取病死鴿的腦、氣管、肺和肝研磨，加入含雙抗（青霉素、鏈霉素每毫升各 1000IU）PBS制成1∶5的組織液，凍融3次,5000r/min，離心10min,取上清液接種 9～11日齡 SPF雞胚，每枚 0.2mL，置37℃溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果，收集尿囊液檢測其血凝性并盲傳3代。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

原代細(xì)菌在LB培養(yǎng)基上為濕潤，直徑2～4mm的乳白色菌落，第二代在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后出現(xiàn)2～4mm大小的亮粉紅色菌落，周圍有沉淀線環(huán)繞。革蘭氏染色呈典型的革蘭氏陰性中等大小的桿菌。

2.2 生化特性

取純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，由其結(jié)果與上述細(xì)菌培養(yǎng)特性結(jié)合分析得出，所得的細(xì)菌為大腸桿菌，生化反應(yīng)結(jié)果：葡萄糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露醇和山梨醇為陽性；衛(wèi)矛醇、蛋白胨、尿素、水楊苷、硫化氫、木糖和肌醇為陰性。

2.3 藥敏試驗(yàn)

大腸桿菌的耐藥性由培養(yǎng)基上所選擇抗菌藥物的抑菌圈大小與敏感標(biāo)準(zhǔn)來判定，其結(jié)果表明，所分離的鴿大腸桿菌除了對頭孢噻肟高度敏感外，對鏈霉素、復(fù)方新諾明和慶大霉素等15種藥物均不敏感，見表1。

2.4 病毒分離

組織液接種SPF雞胚后培養(yǎng)至120h，雞胚仍無死亡和病變，其尿囊液無血凝性，盲傳3代仍無血凝性，認(rèn)為未分離到病毒，棄之。

3 小結(jié)與討論

3.1 送檢病死鴿組織中未分離到病毒。由病原菌的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性及生化試驗(yàn)確定引起鴿死亡的原因是大腸桿菌感染導(dǎo)致的急性敗血癥，用慶大霉素和阿米卡星治療不佳的原因可從藥敏結(jié)果得到解釋。較多研究結(jié)果表明：大腸桿菌對多種藥物敏感[2～4]：如環(huán)丙沙星、恩諾沙星、先鋒5號及氯霉素高度敏感，而由本次藥敏試驗(yàn)顯示該養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖上濫用抗生素的情況已十分嚴(yán)重，已經(jīng)產(chǎn)生了對卡那霉素、慶大霉素、氯霉素和鏈霉素均耐藥的菌株，在所選的16種抗菌藥物中除了頭孢噻肟，其余藥物對該菌株均產(chǎn)生不同程度的耐藥，應(yīng)引起養(yǎng)殖戶的高度重視。因此建議在確診的基礎(chǔ)上，通過藥敏試驗(yàn)，有目的、有針對性地用藥，避免濫用藥物，

且用藥應(yīng)有足夠療程和劑量，或在使用抗菌藥物的過程中注意交叉用藥或聯(lián)合用藥，以避免菌株耐藥性的增強(qiáng)，盡量減少耐藥菌株產(chǎn)生。

表1 大腸桿菌分離株對16種抗菌藥物的耐藥性

3.2 為了防止該病的發(fā)生，要提高機(jī)體抵抗力，給予全面營養(yǎng)，飼料中補(bǔ)充足量維生素、微量元素，同時要注意搞好環(huán)境衛(wèi)生，定期對本地區(qū)鴿大腸桿菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測及使用疫苗加強(qiáng)免疫，這些措施均能有效預(yù)防鴿大腸桿菌病的發(fā)生，從而減少臨床用藥，減少耐藥菌株產(chǎn)生，以降低疫病防治的難度。

[1]塞弗（美）主編.禽病學(xué)［M］.第 11版.蘇敬良，高福，索勛主譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005，174-176.

[2]李鵬,王家鄉(xiāng).鴿大腸桿菌病的診斷及防治［J］.湖北畜牧獸醫(yī)，2006，8∶34.

[3]曾桂有.鴿大腸桿菌病的診治［J］.中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2001，18(13)∶23.

[4]趙光偉，鄭琳紅，張成偉，等.鴿場大腸桿菌和沙門氏菌的分離鑒定及其藥敏試驗(yàn)[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2010，6∶11-13.

S854.4+3

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1008-3847（2011）05-0006-02

丁煥中