謝 岑,鐘大放,陳笑艷

(中國科學(xué)院上海藥物研究所,上海 201203)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測反應(yīng)性代謝物

謝 岑,鐘大放,陳笑艷

(中國科學(xué)院上海藥物研究所,上海 201203)

已有報道一些藥物進入體內(nèi)后在各種代謝酶的作用下轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性代謝物,然后與生物大分子(如蛋白、DNA)共價結(jié)合,導(dǎo)致毒性。在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段進行反應(yīng)性代謝物篩查,對上市藥物進行反應(yīng)性代謝物監(jiān)測已經(jīng)成為一個重要的研究領(lǐng)域。通常,反應(yīng)性代謝物具有親電性,能被小分子親核試劑(如谷胱甘肽及其衍生物、氰離子、胺類等)體外捕獲,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測并鑒定這些結(jié)合物的結(jié)構(gòu)是研究反應(yīng)性代謝物的基本方法。本文綜述了液相色譜與不同質(zhì)譜儀聯(lián)用(三重四極桿、離子阱、四極桿-線性離子阱、高分辨質(zhì)譜儀)檢測反應(yīng)性代謝產(chǎn)物的方法以及應(yīng)用進展。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS);反應(yīng)性代謝物;捕獲試劑

藥物在體內(nèi)經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后,生成的代謝產(chǎn)物大多數(shù)極性增加、水溶性提高、藥理活性減弱或完全失活,因此,代謝反應(yīng)常被認(rèn)為是生物解毒過程。在某些情況下是經(jīng)過代謝形成具有親電性的反應(yīng)性代謝中間體;但在更多情況下是經(jīng)代謝形成的具有親電性的反應(yīng)性代謝中間體導(dǎo)致毒性的,它們可通過烷化、酰化與生物大分子(DNA或蛋白質(zhì))發(fā)生共價結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞功能瓦解或激發(fā)免疫反應(yīng)[1]。反應(yīng)性代謝產(chǎn)物或中間體的生成往往是在藥物代謝酶介導(dǎo)下產(chǎn)生的,稱為生物活化過程。

由于化學(xué)不穩(wěn)定性以及體內(nèi)存在一些去毒性代謝途徑,藥物代謝過程中生成的高反應(yīng)性親電代謝物或中間體不易被測出。目前,常使用帶NADPH的肝微粒體以及適當(dāng)?shù)挠H核性捕獲劑鑒定反應(yīng)性代謝產(chǎn)物[2-3],例如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸、氰離子、氨基脲和甲氧基胺類等。根據(jù)與反應(yīng)性代謝物結(jié)合的親核物質(zhì)類型,可以將反應(yīng)性代謝物分為“強”親電性代謝物和“弱”親電性代謝物。其中,與含N、O和C親核物質(zhì)反應(yīng)的為“強”親電性代謝物,與含S親核試劑反應(yīng)的為“弱”親電性代謝物[3]。

目前,已有很多關(guān)于藥物在CYP450等酶的催化下,在體內(nèi)形成反應(yīng)性代謝物而導(dǎo)致藥物毒性的報道[4-9]。如降糖藥曲格列酮、抗抑郁藥萘法唑酮等藥物,被證明產(chǎn)生反應(yīng)性代謝中間體,與蛋白生成加合物可以導(dǎo)致嚴(yán)重的肝毒性,因此先后撤出市場。一些藥用植物成分,如馬兜鈴酸、吡咯里西啶類生物堿、異喹啉類生物堿等,也被證明生成的反應(yīng)性代謝物導(dǎo)致毒性。在藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段進行反應(yīng)性代謝物篩查,對上市藥物進行反應(yīng)性代謝物監(jiān)測已經(jīng)成為藥物代謝毒理學(xué)的重要研究領(lǐng)域。本文將主要介紹液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法應(yīng)用于反應(yīng)性代謝物檢測和鑒定以及應(yīng)用進展。

1 谷胱甘肽捕獲反應(yīng)性代謝物

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由3個氨基酸(谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)組成的小肽,分子中存在1個巰基,可以與反應(yīng)性代謝中間體的親電基團(如苯醌、苯醌亞胺、Michael受體等)反應(yīng),形成穩(wěn)定的結(jié)合物。在正離子掃描模式下,GSH結(jié)合物具有相似的質(zhì)譜裂解規(guī)律,示于圖1。通常易中性丟失129 u(焦谷氨酸)產(chǎn)生e型碎片離子,因此,利用中性丟失掃描129 u可以快速檢測 GSH結(jié)合物,這是篩選 GSH結(jié)合物的傳統(tǒng)方法[10]。但在正離子模式下,中性丟失掃描檢測 GSH結(jié)合物的方法主要存在兩方面不足:其一是選擇性差,基質(zhì)中的許多內(nèi)源性物質(zhì)均能產(chǎn)生與GSH結(jié)合物無關(guān)的129 u中性丟失,因此,在進行復(fù)雜生物樣品分析時易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[11];其二,并非所有 GSH結(jié)合物都會產(chǎn)生129 u中性丟失,如在正離子模式下,脂肪族及芐位的硫醚型 GSH結(jié)合物通常產(chǎn)生307 u(GSH)中性丟失,而硫酯一般先丟失焦谷氨酸,然后脫去一分子水,即產(chǎn)生147 u中性丟失[12],對于這些類型的結(jié)合物,如果只掃描129 u中性丟失就會引入假陰性結(jié)果。

為了提高選擇性,減少假陽性結(jié)果的產(chǎn)生,可以采用 Q-TOF質(zhì)譜精確中性丟失掃描129.042 6 u(焦谷氨酸的精確分子質(zhì)量)以檢測GSH結(jié)合物[13]。一般情況,內(nèi)源性物質(zhì)會產(chǎn)生與GSH結(jié)合物相同理論質(zhì)量的中性丟失(129 u),但很難產(chǎn)生相同精確質(zhì)量的中性丟失(129.042 6 u),因此,采用Q-TOF高分辨質(zhì)譜可以有效減少內(nèi)源性物質(zhì)對結(jié)果的干擾,從而減少假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。Q-TOF質(zhì)譜并不具有真正的中性丟失掃描,而是在兩次不同碰撞能量的全掃描之間來回切換,低能量(5 eV)下獲得前體離子,高能量(20 eV)下獲得產(chǎn)物離子,從而實現(xiàn)“偽”中性丟失掃描。當(dāng)儀器檢測到能產(chǎn)生129.042 6 u中性丟失的前體離子時,即可對其進行產(chǎn)物離子掃描。與傳統(tǒng)的中性丟失掃描相比,利用Q-TOF質(zhì)譜進行中性丟失掃描可以提供更高的選擇性,高分辨的碎片離子信息有助于GSH結(jié)合物的結(jié)構(gòu)解析,一次進樣的同時采集了前體離子和產(chǎn)物離子,大大縮短了分析時間。

應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的GSH作為捕獲劑,可以有效的識別假陽性結(jié)果[15-16]。將天然存在的GSH與穩(wěn)定同位素標(biāo)記的 GSH(GSX,13C2-15N標(biāo)記在甘氨酸殘基)等摩爾比混合,以捕獲微粒體孵化液中的反應(yīng)性代謝物,采用中性丟失掃描129 u進行檢測。GSH/GSX結(jié)合物在對應(yīng)的質(zhì)譜圖中能產(chǎn)生相差3 u的同位素峰,豐度比為1∶1。采用這種方法檢測對乙酰氨基酚在人肝微粒體中的反應(yīng)性代謝物,在中性丟失掃描的總離子流圖中主要檢測到3個色譜峰,但僅在1個峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖中觀察到m/z457/460一對等豐度的同位素峰,因此確定另2個峰為假陽性結(jié)果。

為了減少假陰性結(jié)果的產(chǎn)生,Dieckhaus等[17]研究各種類型(苯環(huán)、芐基、脂肪族和硫酯)的GSH結(jié)合物在負(fù)離子模式下的二級質(zhì)譜圖后發(fā)現(xiàn),盡管結(jié)合位點和類型不同,但是所有的結(jié)合物具有與GSH分子相同的質(zhì)譜裂解規(guī)律,即均能產(chǎn)生響應(yīng)較強的m/z272碎片離子,示于圖2。因此,可以在負(fù)離子模式下對m/z272碎片離子進行前體離子掃描,更全面地篩選各種類型的GSH結(jié)合物。通常,GSH結(jié)合物在負(fù)離子下產(chǎn)生的碎片離子主要來自于 GSH分子,而在正離子下產(chǎn)生的碎片離子主要來自于藥物分子,因此,在正離子模式下獲得的二級質(zhì)譜圖更有利于結(jié)構(gòu)解析[17]。Wen等[18]利用Q-Trap的正負(fù)離子切換功能,在負(fù)離子下進行前體離子掃描(m/z272)以作為探測掃描,對于信號強度超過閾值的離子則切換到正離子模式下進行增強的產(chǎn)物離子掃描,以獲得探測掃描所得前體離子的高質(zhì)量產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖,從而實現(xiàn)高通量篩選和鑒定反應(yīng)性代謝物。該方法已被成功地應(yīng)用于多種藥物的反應(yīng)性代謝物檢測,如對乙酰氨基酚[18]、曲唑酮[19]、阿米替林及其代謝物去甲替林[20]。與中性丟失掃描相比,前體離子掃描(m/z272)表現(xiàn)出更高的靈敏度和選擇性[18]。為了進一步提高檢測靈敏度,并減少假陽性結(jié)果,可以同時對m/z272和m/z254(由m/z272碎片離子脫水產(chǎn)生)兩個碎片離子進行雙前體離子掃描[21]。

圖1 谷胱甘肽結(jié)合物的特征碎片離子[14]Fig.1 Characteristic fragment ions of glutathione conjugates under collision-induced dissociation[14]

圖2 推測的GSH在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜裂解途徑[17]Fig.2 Proposed fragmentation of GSHunder negative mode following collision-induced dissociation[17]

Zheng等[22]開發(fā)了一種新型的分析方法,采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)結(jié)合增強的產(chǎn)物離子掃描快速篩選和鑒定反應(yīng)性代謝物。在MRM中,根據(jù)可能的 GSH結(jié)合物類型設(shè)定前體離子,將其中性丟失129 u和307 u后的碎片離子作為監(jiān)測的產(chǎn)物離子,同時對114對的離子反應(yīng)進行監(jiān)測,對其中信號強度超過閾值的離子進行增強的產(chǎn)物離子掃描。采用該方法對若干模型化合物(包括對乙酰氨基酚、雙氯芬酸和卡馬西平的反應(yīng)性代謝物)進行檢測,結(jié)果表明,基于MRM的方法靈敏度比傳統(tǒng)的中性丟失掃描最多可提高179倍,比前體離子掃描提高了10倍。與傳統(tǒng)的中性丟失掃描相比,該方法的選擇性也有較大的提高。例如,采用該方法檢測出卡馬西平在人肝微粒體孵化液中的7種 GSH結(jié)合物,而由于受到內(nèi)源性物質(zhì)干擾,傳統(tǒng)的中性丟失掃描僅能檢測出其中的2種。然而,這種方法的應(yīng)用也有局限性,它只能用于檢測常規(guī)的可被預(yù)測的 GSH結(jié)合物,而對那些非常規(guī)的結(jié)合物,采用中性丟失和前體離子掃描則更有效。

高分辨質(zhì)譜多數(shù)不具備中性丟失、前體離子掃描和MRM功能,這就限制其在檢測復(fù)雜基質(zhì)代謝物中的應(yīng)用。為了克服這一缺點,Zhang[22]和Zhu等[23]利用代謝物與原形藥物具有相近的質(zhì)量虧損,開發(fā)了質(zhì)量虧損過濾(mass defect filter,MDF)技術(shù),它屬于數(shù)據(jù)后處理技術(shù),可用于篩選各種常規(guī)和非常規(guī)的代謝產(chǎn)物。常見GSH結(jié)合物的質(zhì)量虧損列于表1。對7種模型化合物的肝微粒體孵化液或膽汁中 GSH結(jié)合物的檢測表明,該方法具有更高的靈敏度和選擇性,高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)也有助于結(jié)合物分子式組成的確定和結(jié)構(gòu)解析[24]。

Zhang等[25]開發(fā)了一種新型的數(shù)據(jù)處理技術(shù),稱為背景扣除法。它是通過比較特定時間段內(nèi)給藥樣品與對照樣品的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù),自動識別并扣除與背景相關(guān)的信號,從而篩查可能的代謝物相關(guān)離子。這種方法被用于雙氯芬酸在人肝微粒體孵化液中反應(yīng)性代謝物的檢測。色譜圖經(jīng)背景扣除處理后,共檢測到10種 GSH結(jié)合物,而這些結(jié)合物在未經(jīng)處理的色譜圖中是難以觀察到的;同樣,質(zhì)譜圖經(jīng)背景扣除處理后,可以清晰地觀察到 GSH結(jié)合物的雙電荷離子峰和三電荷離子峰,但在未經(jīng)處理的質(zhì)譜圖中,這兩個離子被大量的內(nèi)源性干擾離子包圍。該方法與MDF技術(shù)聯(lián)合使用已成功地用于檢測大鼠血漿、膽汁和尿中曲格列酮的反應(yīng)性代謝物[26]。由此可見,背景扣除法可以有效地檢測各種復(fù)雜生物基質(zhì)中的反應(yīng)性代謝物,減少內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,且不需要對代謝物的質(zhì)量數(shù)和質(zhì)譜裂解途徑進行預(yù)判,它對于在離子源中形成的多電荷離子GSH結(jié)合物的檢測尤為重要。

表1 在人肝微粒體孵化液中常見反應(yīng)性代謝物的GSH結(jié)合物的質(zhì)量變化和質(zhì)量虧損[11]Table 1 Mass shifts and mass defects of GSHadducts of common reactive metabolites formed in human liver microsomes[11]

為了進一步提高選擇性,將天然存在的GSH與穩(wěn)定同位素標(biāo)記的 GSX按摩爾比2∶1混合,用于捕獲微粒體孵化液中的反應(yīng)性代謝物[27]。采用L TQ-Orbitrap質(zhì)譜檢測,對于能產(chǎn)生特征同位素峰的離子自動進行產(chǎn)物離子掃描;采用MDF、同位素峰分布過濾和背景扣除技術(shù)進行數(shù)據(jù)后處理,能快速、高效地篩選對乙酰氨基酚等藥物的反應(yīng)性代謝物。

2 谷胱甘肽衍生物捕獲反應(yīng)性代謝物

通常,為了滿足質(zhì)譜檢測靈敏度的要求而使用高濃度的底物與肝微粒體共同孵化,但如果化合物的溶解度較差,則不能獲得高濃度的孵化液,這可能導(dǎo)致無法檢測到反應(yīng)性代謝物。由于GSH結(jié)構(gòu)中含有羧基,會降低正離子檢測的靈敏度,因此以谷胱甘肽乙酯(GSH-EE,圖3a)為捕獲試劑,在正離子模式下可獲得較強的質(zhì)譜響應(yīng);GSH-EE的谷氨酸殘基未發(fā)生改變,會產(chǎn)生129 u中性丟失,因此可采用中性丟失掃描129 u進行檢測[28]。實驗表明,GSH-EE結(jié)合物的質(zhì)譜響應(yīng)比普通的 GSH結(jié)合物高了近10倍,對于溶解度差的化合物,即使降低其在孵化體系中的濃度,也不影響反應(yīng)性代謝產(chǎn)物的檢測。Wen等[29]以 GSH-EE作為捕獲劑,在負(fù)離子下進行前體離子掃描(m/z300),再切換到正離子模式下進行增強的產(chǎn)物離子掃描,可以有效地消除肝微粒體中少量內(nèi)源性GSH結(jié)合物的干擾。

γ-谷氨酰半胱氨酰賴氨酸(GSK,圖3b)是一種將GSH中的甘氨酸用賴氨酸替換的新型捕獲試劑,它可以同時篩選“軟”和“硬”反應(yīng)性代謝產(chǎn)物[30]。由于 GSK結(jié)構(gòu)中保留了谷氨酸殘基,因此其結(jié)合物在正離子模式下仍可產(chǎn)生129 u中性丟失。將 GSK與13C6-15N2-GSK(標(biāo)記在賴氨酸殘基)等摩爾比混合,捕獲反應(yīng)性代謝物,利用中性丟失掃描129 u,GSK/13C6-15N2-GSK結(jié)合物能產(chǎn)生相差8 u的等豐度同位素峰。該方法具有快速、靈敏和可靠的特點,可以在體外篩選不同類型的反應(yīng)性代謝物。

除 GSH外,N-乙酰半胱氨酸(NAC,圖3c)也可以作為“軟”反應(yīng)性代謝物的捕獲試劑。在負(fù)離子模式下,NAC會產(chǎn)生特征的129 u中性丟失(由NAC硫醚鍵斷裂產(chǎn)生的),因此可通過中性丟失掃描快速篩選NAC結(jié)合物,也可根據(jù)可能的NAC結(jié)合物設(shè)定前體離子,將其中性丟失129 u后的碎片離子作為監(jiān)測的產(chǎn)物離子,同時對多對離子反應(yīng)進行 MRM檢測[31]。Jian等[32]采用負(fù)離子模式下的中性丟失掃描(或MRM)結(jié)合正離子模式下的增強產(chǎn)物離子掃描,快速篩查和鑒定了肝微粒體和尿中的NAC結(jié)合物。在某些情況下,NAC可代替 GSH作為親核捕獲劑,但當(dāng)加合反應(yīng)由谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化(即使是部分催化)時,NAC不再適用。

如上文所述,將 GSH和穩(wěn)定同位素標(biāo)記的GSX按一定比例混合作為捕獲劑,通過同位素峰分布過濾的方法可以有效地篩查反應(yīng)性代謝物。但穩(wěn)定同位素標(biāo)記的 GSX較為昂貴,限制了該方法的廣泛使用。因此,LeBlanc[33]設(shè)計了一種新型捕獲試劑N-2-溴-芐氧羰基谷胱甘肽(GSH-Br,圖3d),它與反應(yīng)性代謝物形成的結(jié)合物在質(zhì)譜中會產(chǎn)生相差2 u的等豐度同位素峰,利用同位素峰分布過濾和MDF技術(shù)對結(jié)果進行篩選,可以提高選擇性,消除假陽性結(jié)果。

將谷胱甘肽與熒光基團丹磺?；磻?yīng)生成丹磺酰谷胱甘肽(d-GSH,圖 3e),采用 LCFLD-MS/MS法進行測定,可以實現(xiàn)對反應(yīng)性代謝物的定量分析[34]。d-GSH結(jié)合物的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為340 nm和525 nm。實驗表明,d-GSH和 GSH具有相近的反應(yīng)活性,但d-GSH不是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的輔酶,所以對篩選需要谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化的化合物不適用。此外,該方法需要較長的色譜運行時間,不能用于高通量篩選。

Soglia[35]報道了以季銨型谷胱甘肽衍生物(QA-GSH,圖 3f)作為捕獲劑,采用 LC-MS/MS法對反應(yīng)性代謝物進行半定量分析。QAGSH帶1個正電荷,可以增強離子化效率而提高檢測靈敏度,也可以使不同的QA-GSH結(jié)合物具有相近的質(zhì)譜響應(yīng)。對3種化合物及其QA-GSH結(jié)合物的對照品進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),3種化合物的質(zhì)譜響應(yīng)具有19倍的差異,但是結(jié)合物對照品的質(zhì)譜響應(yīng)差別在3倍以內(nèi),表明不同QA-GSH結(jié)合物的質(zhì)譜響應(yīng)具有均一性。因此,可以用具有對照品的QA-GSH結(jié)合物對候選化合物的QA-GSH結(jié)合物進行半定量分析,從而評價化合物生物活化水平。通過對不同QA-GSH結(jié)合物的二級質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),它們均具有相同的m/z144碎片離子,因此以 QAGSH結(jié)合物的相對分子質(zhì)量作為前體離子,以m/z144碎片離子作為監(jiān)測的產(chǎn)物離子,采用MRM法進行半定量測定,示于圖4。但這種方法存在3點不足:1)只能與“軟”反應(yīng)性代謝物結(jié)合,因此無法對所有的反應(yīng)性代謝物進行半定量分析;2)不適用于雙QA-GSH或多QA-GSH結(jié)合物;3)不適用于需要谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化的化合物。

圖3 各種GSH衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures of different GSH derivatives

圖4 LC-MS/MS法對 QA-GSH結(jié)合物進行半定量分析[35]Fig.4 A semiquantitative method for the determination of QA-GSHconjugate by LC-MS/MS[35]

3 氰離子捕獲反應(yīng)性代謝物

氰離子(CN-)是一種“硬”親核試劑,可用于捕獲亞胺正離子型反應(yīng)性代謝物,示于圖5。文獻[36-37]采用 K14CN作為捕獲試劑,檢測并定量亞胺正離子型的反應(yīng)性代謝物。這種方法雖然選擇性高,但是成本高,限制了它的使用。

正離子模式下,氰基結(jié)合物會產(chǎn)生特征的27 u(HCN)中性丟失,因此,可通過中性丟失掃描(27 u)快速篩選氰基結(jié)合物[38]。但進行中性丟失掃描(27 u)時發(fā)現(xiàn),許多內(nèi)源性物質(zhì)也會產(chǎn)生相同的中性丟失,極易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此,可以采用等摩爾比混合的 KCN和穩(wěn)定同位素標(biāo)記的 K13C15N作為捕獲劑,對27 u和29 u(HCN和 H13C15N)進行中性丟失掃描,氰基結(jié)合物會產(chǎn)生相差2 u(單加合物)或4 u(雙加合物),且豐度比為1∶1的1對同位素峰[39]。這種方法可以有效地檢測亞胺正離子型的反應(yīng)性代謝物,目前已廣泛應(yīng)用于脂環(huán)胺類藥物(氯氮平、酮康唑、環(huán)丙沙星、噻氯匹啶等)的反應(yīng)性代謝物研究中[2,39-40]。

4 氨基脲和甲氧基胺捕獲反應(yīng)性代謝物

圖5 氰離子捕獲亞胺正離子型反應(yīng)性代謝物[40]Fig.5 Use of cyanide to trap an iminium ion reactive metabolite[40]

有些藥物經(jīng)代謝活化會生成帶有醛基的反應(yīng)性代謝物,代謝物可與蛋白上的堿性氨基反應(yīng)形成希夫氏堿,這種醛型反應(yīng)性代謝物也可被氨基脲或甲氧基胺等“硬”親核試劑所捕獲。代表性的實驗方法是向孵育體系中加入5 mmol/L氨基脲或甲氧基胺,然后進行 LC-MS/MS分析[2,14,39]。

Zhang等[41-42]以氨基脲和甲氧基胺作為捕獲劑,研究了L-739010和L-746530的生物活化途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩個化合物結(jié)構(gòu)中的呋喃環(huán)均會在CYP3A酶的催化下開環(huán),形成醛型反應(yīng)性代謝物,后者可被氨基脲和甲氧基胺捕獲,通過LC-MS/MS分析,鑒定了結(jié)合物的結(jié)構(gòu),從而推測了可能的生物活化途徑,示于圖6。

圖6 采用甲氧基胺或氨基脲捕獲呋喃的醛型反應(yīng)性代謝物Fig.6 Use of methoxylamine and semicarbazide to trap an aldehyde reactive metabolite

5 反應(yīng)性代謝物研究舉例

蝙蝠葛堿為一種雙芐基四氫異喹啉類生物堿,含有亞甲基苯酚結(jié)構(gòu)。本實驗室[6]采用LC/MSn法檢測其在人肝微粒體孵化液和SD大鼠膽汁中的反應(yīng)性代謝物。在人肝微粒體孵化液中共檢測到4種 GSH結(jié)合物(M6、M7-1、M7-2和M8,示于圖7),在大鼠膽汁中共檢測到3種GSH結(jié)合物(M6、M7-1和M7-2)。為了確定結(jié)構(gòu),選擇性的進行多級全掃描質(zhì)譜分析,M6～M8產(chǎn)生的主要中性丟失均為129 u(焦谷氨酸)、273 u(GSH-H2S)和 307 u(GSH)。通過與化學(xué)合成的對照品比對,最終確定M6為原形蝙蝠葛堿GSH結(jié)合物,M7-1和M7-2為2-N-去甲基蝙蝠葛堿GSH結(jié)合物,M8為N-去甲基-O-去甲基蝙蝠葛堿 GSH結(jié)合物,GSH均結(jié)合在C-17位上。這表明,蝙蝠葛堿的生物活化途徑主要是經(jīng)代謝酶氧化生成對亞甲基醌型反應(yīng)性代謝中間體。Zheng等[43]采用CD-1小鼠和人肺細(xì)胞株進行毒性研究,發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛堿可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺毒性,且與反應(yīng)性代謝物生成有關(guān)。

圖7 蝙蝠葛堿人肝微粒體孵化液中檢測到的 GSH結(jié)合物[6]Fig.7 Extracted ion[M+H]+and[M+2H]2+chromatograms of four dauricine-derived GSH conjugates in human liver microsomal incubations[6]

4-壬基苯酚(4-NP)為常見的環(huán)境污染物,具有生殖毒性。本實驗室[44]采用 UPLC/QTOF MS法研究了4-NP在人肝微粒體中的生物活化過程。將4-NP與人肝微粒體共同孵化,加入NADPH啟始反應(yīng),GSH捕獲反應(yīng)性代謝物,采用 MDF的 GSH篩查功能處理色譜圖。在孵化體系中共檢測到6種結(jié)合物,示于圖8。采用MDF的常規(guī)代謝物篩選功能處理色譜圖,在孵化體系中共檢測到19種氧化代謝物。根據(jù)獲得的高分辨質(zhì)譜信息,鑒定了代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),證明4-NP主要有兩種生物活化途徑:其一是4-NP直接氧化為亞甲基醌型反應(yīng)性中間體;其二是4-NP先經(jīng)羥基化生成鄰二酚羥基,后者再自氧化形成鄰醌型反應(yīng)性中間體。

圖8 采用 Q-TOF質(zhì)譜法和MDF技術(shù)檢測到4-壬基苯酚在人肝微粒體中的 GSH結(jié)合物[44]Fig.8 Q-TOF MS and MDF analysis of 4-nonylphenol-derived GSH conjugates formed in the human liver microsomal incubations[44]

綠原酸為多種中藥注射劑(雙黃連、清開靈、脈絡(luò)寧注射液等)的主要成分之一,本文作者[45]采用UPLC/Q-TOF MS法研究了SD大鼠靜脈注射綠原酸后,膽汁、尿、糞和血漿中可能的代謝產(chǎn)物。采用MDF技術(shù)對高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理,除原形藥物外,共檢測到35種代謝產(chǎn)物,其中,膽汁中19種、尿中18種、糞中12種、血漿中3種,推測的代謝途徑示于圖9。在膽汁中檢測到了多種 GSH結(jié)合物,如綠原酸及O-甲基綠原酸的 GSH結(jié)合物(M4和M5)和綠原酸水解產(chǎn)物咖啡酸的 GSH結(jié)合物(M6),此外,在膽汁及糞中還檢測到了 GSH結(jié)合物的次級降解產(chǎn)物O-甲基綠原酸半胱氨酰甘氨酸結(jié)合物(M2)和O-甲基綠原酸半胱氨酸結(jié)合物(M3)。實驗結(jié)果提示,綠原酸的烯酮雙鍵具有很強的親電性,可能與蛋白的巰基共價結(jié)合導(dǎo)致過敏性不良反應(yīng),該項研究為認(rèn)識含綠原酸中藥注射劑的過敏性反應(yīng)機理提供了重要線索。

圖9 推測的大鼠體內(nèi)綠原酸主要代謝途徑[45]Fig.9 Proposed major metabolic pathways of chlorogenic acid in rats[45]

6 挑戰(zhàn)與展望

檢測反應(yīng)性代謝物在藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展階段越來越受到重視。盡早進行反應(yīng)性代謝物研究,鑒定易代謝活化的位點,有助于設(shè)計新的候選藥物,降低藥物毒性、提高藥物開發(fā)的成功率。LC-MS/MS已經(jīng)成為檢測和鑒定反應(yīng)性代謝物的重要方法。目前,質(zhì)譜技術(shù)(包括三重四極桿、離子阱、四極桿-線性離子阱、高分辨質(zhì)譜)的發(fā)展、數(shù)據(jù)處理方法(MDF和背景扣除法)的開發(fā)、各種捕獲試劑的應(yīng)用,極大推動了反應(yīng)性代謝物的研究,可實現(xiàn)高通量篩選。

然而,由于藥物結(jié)合 GSH后,結(jié)合物的質(zhì)譜響應(yīng)通常與原形差異較大,所以常規(guī)的質(zhì)譜方法無法實現(xiàn)對反應(yīng)性代謝物的定量測定和該代謝途徑規(guī)模的獲知。反應(yīng)性代謝物最直接的定量方法是通過化學(xué)合成對照品或采用放射性標(biāo)記方法進行定量,但是一般反應(yīng)性代謝物篩查是在早期的藥物發(fā)現(xiàn)階段進行,化學(xué)合成對照品或標(biāo)記化合物周期長且難度大,不能滿足高通量的要求。LC/UV法可以用于 GSH結(jié)合物的定量測定,但受到靈敏度的限制[11]。一些新型的捕獲試劑,如連有熒光基團的丹磺酰谷胱甘肽[34]和季銨型谷胱甘肽[35],也被用于反應(yīng)性代謝物的定量或半定量研究中,但是這些結(jié)構(gòu)修飾是否會影響 GSH的反應(yīng)活性仍不明確,且 GSH衍生物絕大多數(shù)不是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的底物。Valaskovic等[46]利用超低流速的納升噴霧(nanospray)技術(shù),可大致按等摩爾比將代謝物的質(zhì)譜響應(yīng)歸一化,從而初步實現(xiàn)對代謝物的定量分析,但這種方法尚未被廣泛地用于反應(yīng)性代謝物的研究中?？傮w來說,定量評價反應(yīng)性代謝物仍面臨極大的挑戰(zhàn),因此,需要進一步開發(fā)新的質(zhì)譜技術(shù)和適用性更廣的捕獲試劑,以實現(xiàn)快速準(zhǔn)確定量反應(yīng)性代謝物。

[1]PARK B K,KITTERINGHAM N R,MAGGS J L,et al.The role of metabolic activation in druginduced hepatotoxicity[J]. AnnualReview of Pharmacology and Toxicology, 2005, 45:177-202.

[2]EVANS D C,WATT A P,NICOLL-GRIFFITH D A,et al.Drug-protein adducts:an industry perspective on minimizing the potential for drug bioactivation in drug discovery and development[J].Chemical Research in Toxicology,2004,17(1):3-16.

[3]ZHOU S,CHAN E,DUAN W,et al.Drug bioactivation,covalent binding to target proteins and toxicity relevance[J].Drug Metabolism Reviews,2005,37(1):41-213.

[4]TANGJ,AKAO T,NAKAMURA N,et al.In vitro metabolism of isoline,a pyrrolizidine alkaloid from Ligularia duciformis,by rodent liver microsomal esterase and enhanced hepatotoxicity by esterase inhibitors[J].Drug Metab Lism and Disposition:The Biological Fate of Chemicals,2007,35(10):1 832-1 839.

[5]XIA Q,YAN J,CHOU M W,et al.Formation of DHP-derived DNA adducts from metabolic activation of the prototype heliotridine-type pyrrolizidine alkaloid,heliotrine[J].Toxicology Letters,2008,178(2):77-82.

[6]WANG Y,ZHONG D,CHEN X,et al.Identification of quinone methide metabolites of dauricine in human liver microsomes and in rat bile[J].Chemical Research in Toxicology,2009,22(5):824-834.

[7]KAL GU TKAR A S,VAZ A D,LAM E M E,et al.Bioactivation of the nontricyclic antidepressant nefazodone to a reactive quinone-imine species in human liver microsomes and recombinant cytochrome P450 3A4[J].Drug Metab Lism and Disposition:The Biological Fate of Chemicals,2005,33(2):243-253.

[8]KASSA HUN K,PEARSON P G,TAN G W,et al.Studies on the metabolism of troglitazone to reactive intermediates in vitro and in vivo.Evidence for novel biotransformation pathways involving quinone methide formation and thiazolidinedione ring scission[J].Chemical Research in Toxicology,2000,14(1):62-70.

[9]ZHOU S F,XUE C C,YU X Q,et al.Metabolic activation of herbal and dietary constituents and its clinical and toxicological implications:An update[J].Curr Drug Metab,2007,8(6):526-553.

[10]CHEN W G,ZHANG C,AVERY M J,et al.Reactive metabolite screen for reducing candidate attrition in drug discovery[J].Advances in Experimental Medicine and Biology,2001,500:521-524.

[11]MA S,ZHU M.Recent advances in applications of liquid chromatography-tandem mass spectrometry to the analysis of reactive drug metabolites[J].Chemico-Biological Interactions,2009,179(1):25-37.

[12]GRILLO M P,HUA F,KNUTSON C G,et al.Mechanistic studies on the bioactivation of diclofenac:identification of diclofenac-S-acyl-glutathione in vitro in incubations with rat and human hepatocytes[J].Chemical Research in Toxicology,2003,16(11):1 410-1 417.

[13]CASTRO-PEREZ J,PLUMB R,L IAN G L,et al.A high-throughput liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for screening glutathione conjugates using exact mass neutral loss acquisition[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2005,19(6):798-804.

[14]MA S,SUBRAMANIAN R.Detecting and characterizing reactive metabolites by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Journal of Mass Spectrometry,2006,41(9):1 121-1 139.

[15]YAN Z,CALDWELL G W.Stable-isotope trapping and high-throughput screenings of reactive metabolites using the isotope MS signature[J].Analytical Chemistry,2004,76(23):6 835-6 847.

[16]MU TL IB A,LAM W,A THERTON J,et al.Application of stable isotope labeled glutathione and rapid scanning mass spectrometers in detecting and characterizing reactive metabolites[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2005,19(23):3 482-3 492.

[17]DIECKHAUS C M,FERN NDEZ-METZL ER C L,KING R,et al.Negative ion tandem mass spectrometry for the detection of glutathione conjugates[J].Chemical Research in Toxicology,2005,18(4):630-638.

[18]WEN B,MA L,NELSON S D,et al.High-throughput screening and characterization of reactive metabolites using polarity switching of hybrid triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry[J].Analytical Chemistry,2008,80(5):1 788-1 799.

[19]WEN B,MA L,RODRIGUES A D,et al.Detection of novel reactive metabolites of trazodone:evidence for CYP2D6-mediated bioactivation of m-chlorophenylpiperazine[J].Drug Metabolism and Disposition,2008,36(5):841-850.

[20]WEN B,MA L,ZHU M.Bioactivation of the tricyclic antidepressant amitriptyline and its metabolite nortriptyline to arene oxide intermediates in human liver microsomes and recombinant P450s[J]. Chemico-Biological Interactions,2008,173(1):59-67.

[21]MAHAJAN M K,EVANS C A.Dual negative precursor ion scan approach for rapid detection of glutathione conjugates using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2008,22(7):1 032-1 040.

[22]ZHENGJ,MA L,XIN B,et al.Screening and identification of GSH-trapped reactive metabolites using hybrid triple quadruple linear ion trap mass spectrometry[J].Chemical Research in Toxicology,2007,20(5):757-766.

[23]ZHANG H,ZHANGD,RAY K.A software filter to remove interference ions from drug metabolites in accurate mass liquid chromatography/mass spectrometric analyses[J].Journal of Mass Spectrometry,2003,38(10):1 110-1 112.

[24]RUAN Q,PETERMAN S,SZEWC M A,et al.An integrated method for metabolite detection and identification using a linear ion trap/orbitrap mass spectrometer and multiple data processing techniques:application to indinavir metabolite detection[J].Journal of Mass Spectrometry,2008,43(2):251-261.

[25]ZHANG H,YANG Y.An algorithm for thorough background subtraction from high-resolution LC/MS data:Application for detection of glutathione-trapped reactive metabolites[J].Journal of Mass Spectrometry,2008,43(9):1 181-1 190.

[26]ZHANG H,MA L,HE K,et al.An algorithm for thorough background subtraction from highresolution LC/MS data:Application to the detection of troglitazone metabolites in rat plasma,bile,and urine[J].Journal of Mass Spectrometry,2008,43(9):1 191-1 200.

[27]LIM H K,CHEN J,COOK K,et al.A generic method to detect electrophilic intermediates using isotopic pattern triggered data-dependent highresolution accurate mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2008,22(8):1 295-1 311.

[28]SO GL IA J R,HARRIMAN S P,ZHAO S,et al.The development of a higher throughput reactive intermediate screening assay incorporating micro-bore liquid chromatography-microelectrospray ionization-tandem mass spectrometry and glutathione ethyl ester as an in vitro conjugating agent[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2004,36(1):105-116.

[29]WEN B,FITCH W L.Screening and characterization of reactive metabolites using glutathione ethyl ester in combination with Q-trap mass spectrometry[J].Journal ofMass Spectrometry,2009,44(1):90-100.

[30]YAN Z,MAHER N,TORRES R,et al.Use of a trapping agent for simultaneous capturing and high-throughput screening of both“soft”and“hard”reactive metabolites[J].Analytical Chemistry,2007,79(11):4 206-4 214.

[31]SCHOLZ K,DEKANT W,VOL KEL W,et al.Rapid detection and identification of N-acetyl-L-cysteine thioethers using constant neutral loss and theoretical multiple reaction monitoring combined with enhanced product-ion scans on a linear ion trap mass spectrometer[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2005,16(12):1 976-1 984.

[32]J IAN W,YAO M,ZHANG D,et al.Rapid detection and characterization of in vitro and urinary N-acetyl-L-cysteine conjugates using quadrupolelinear ion trap mass spectrometry and polarity switching[J].Society,2009:1 246-1 255.

[33]LEBLANC A,SHIAO T C,ROY R,et al.Improved detection of reactive metabolites with a bromine-containing glutathione analog using mass defect and isotope pattern matching[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2010,24(9):1 241-1 250.

[34]GAN J,HARPER T W,HSUEH M M,et al.Dansyl glutathione as a trapping agent for the quantitative estimation and identification of reactive metabolites[J].Chemical Research in Toxicology,2005,18(5):896-903.

[35]SOGLIA J R,CONTILLO L G,KAL GUTKAR A S,et al.A semiquantitative method for the determination of reactive metabolite conjugate levels in vitro utilizing liquid chromatography-tandem mass spectrometry and novel quaternary ammonium glutathione analogues[J].Chemical Research in Toxicology,2006,19(3):480-490.

[36]BAILLIE T A.Metabolism and toxicity of drugs.Two decades of progress in industrial drug metabolism[J].Chemical Research in Toxicology,2008,21(1):129-137.

[37]INOU E K,SHIBA TA Y,TA KA HASHI H,et al.A trapping method for semi-quantitative assessment of reactive metabolite formation using[35S]cysteine and[14C]cyanide[J].Drug Metab Pharmacokinet,2009,24(3):245-254.

[38]ZHANG Z,CHEN Q,LI Y,et al.In vitro bioactivation of dihydrobenzoxathiin selective estrogen receptor modulators by cytochrome P450 3A4 in human liver microsomes:Formation of reactive iminium and quinone type metabolites[J].Chemical Research in Toxicology,2005,18(4):675-685.

[39]ROUSU T,PEL KONEN O,TOLONEN A.Rapid detection and characterization of reactive drug metabolites in vitro using several isotope-labeled trapping agents and ultra-performance liquid chromatography/time-of-flightmass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2009,23(6):843-855.

[40]ARGOTI D,LIANGL,CONTEH A,et al.Cyanide trapping of iminium ion reactive intermediates followed by detection and structure identification using liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)[J].Chemical Research in Toxicology,2005,18(10):1 537-1 544.

[41]CHAURET N,NICOLL-GRIFFITH D,FRIESEN R,et al.Microsomal metabolism of the 5-lipoxygenase inhibitors L-746,530 and L-739,010 to reactive intermediates that covalently bind to protein:the role of the 6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octanyl moiety[J].Drug Metab Lism and Disposition:The Biological Fate of Chemicals,1995,23(12):1 325-1 334.

[42]ZHAN G K E,NAU E J A,ARISON B,et al.Microsomal metabolism of the 5-lipoxygenase inhibitor L-739,010:Evidence for furan bioactivation[J].Chemical Research in Toxicology,1996,9(2):547-554.

[43]J IN H,DAI J,CHEN X,et al.Pulmonary toxicity and metabolic activation of dauricine in CD-1 mice[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2010,332(3):738-746.

[44]DENG P,ZHONG D,NAN F,et al.Evidence for the bioactivation of 4-nonylphenol to quinone methide and ortho-benzoquinone metabolites in human liver microsomes[J].Chemical Research in Toxicology,2010,23(10):1 617-1 628.

[45]謝 岑,鐘大放,陳笑艷.鑒定大鼠注射綠原酸體內(nèi)的代謝產(chǎn)物[J].藥學(xué)學(xué)報,2011,46(1):88-95.

[46]VALASKOVIC G A,U TL EY L,L EE M S,et al.Ultra-low flow nanospray for the normalization of conventional liquid chromatography/mass spectrometry through equimolar response:standard-free quantitative estimation of metabolite levels in drug discovery[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2006,20(7):1 087-1 096.

Applications of Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry to Detection and Characterization of Reactive Metabolites

XIE Cen,ZHONG Da-fang,CHEN Xiao-yan
(S hanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai201203,China)

A number of therapeutical drugs were reported to undergo metabolic activation by drug-metabolizing enzymes.The bioactivation forms reactive metabolite(s),which readily covalently bind to macromolecules,such as proteins and DNA,and then lead to toxicities.In recent years,screening drug candidates for their tendency to generate reactive metabolites during drug discovery and development process and as well monitoring the bioactivation for post-marketing drugs have become increasingly important.Most reactive metabolites are electrophilic in nature and can react with nucleophiles.In vitro microsomal incubations,small nucleophilic molecules,such as glutathione,cyanide and amines are generally used to trap reactive metabolites.Structural elucidation of these stable adducts are conducted by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.In this review,different mass spectrometers including triple quadrupole,ion trap,quadrupole-linear ion trap,and high-resolution mass spectrometer,employed for assessing reactive metabolites are described.The recent advances of different techniques and approaches are also discussed.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);reactive metabolites;trapping agents

陳笑艷(1971～),女,黑龍江人,研究員,從事藥物代謝與藥物動力學(xué)研究。E-mail:xychen@mail.shcnc.ac.cn

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0001-12

2010-12-14;

2010-12-27

國家自然科學(xué)基金項目(30873119)資助

謝 岑(1985～),女,浙江人,博士研究生,從事藥物代謝與藥物動力學(xué)研究。E-mail:carolxc@hotmail.com