馬 萍,李鵬飛,劉麗宏,王淑民,丁春雷

(1.第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部,北京 100088;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院,北京 100730)

HPLC-MS/MS法同時測定人血漿中替米沙坦和氫氯噻嗪的濃度

馬 萍1,李鵬飛1,劉麗宏1,王淑民2,丁春雷1

(1.第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部,北京 100088;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院,北京 100730)

建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法同時測定人血漿中替米沙坦和氫氯噻嗪的濃度。選用Zorbax Eclipse XDB-C 18色譜柱,以乙腈-5 mmol/L乙酸銨為流動相,采用梯度洗脫進(jìn)行分離,樣品用V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液,液-液萃取后進(jìn)樣,選用3200Q-Trap型質(zhì)譜儀的多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描方式進(jìn)行檢測。替米沙坦線性范圍為1.0～1 000.0μg/L,氫氯噻嗪線性范圍為0.6～200.0μg/L,定量下限分別為1.0和0.6μg/L。準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果顯示,方法日間、日內(nèi)變異均小于15%,相對偏差分別為替米沙坦-5.6%～4.3%、氫氯噻嗪-6.3%～2.7%。替米沙坦和氫氯噻嗪的低、中、高3個濃度提取回收率均大于50%,穩(wěn)定性較好。該方法可用于人體替米沙坦和氫氯噻嗪血藥濃度的同時監(jiān)測,以及復(fù)方制劑的人體藥代動力學(xué)研究。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS);替米沙坦;氫氯噻嗪;藥代動力學(xué)

替米沙坦(telmisartan)是一種非肽類、長效血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARB),不僅具有持續(xù)穩(wěn)定的降壓作用,而且還有保鉀、促尿酸排泌、降低尿蛋白的作用[1-2]。但是在所有的降壓藥中,即使針對輕度高血壓患者,單一用藥的有效率也僅為50%～60%[3],大多數(shù)高血壓患者需要2種或以上的降壓藥才能達(dá)到目標(biāo)血壓(＜140/90 mmHg)。小劑量氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide,HCTZ)與 ABR聯(lián)合使用,國外已有替米沙坦和氫氯噻嗪的復(fù)方制劑上市,用于治療輕、中度高血壓病,臨床療效好,安全性高,而且替米沙坦可以克服患者因使用氫氯噻嗪而引起的鉀丟失。

有文獻(xiàn)[4-5]報道同時測定人血漿中替米沙坦和氫氯噻嗪濃度的方法,但定量下限均較高。本實驗擬建立 HPLC-MS/MS法同時測定人血漿中替米沙坦和氫氯噻嗪的濃度,以滿足臨床同時監(jiān)測替米沙坦和氫氯噻嗪的血藥濃度,以及復(fù)方制劑的藥代動力學(xué)和生物等效性的研究。

1 儀器與試藥

3200Q-Trap型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國Applied Biosystem公司產(chǎn)品,配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理軟件;Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng):美國Agilent公司產(chǎn)品,包括四元輸液泵、自動進(jìn)樣器、切換閥。

替米沙坦對照品(批號 M060601,含量99.8%):宜昌長江藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;氫氯噻嗪對照品(批號100309-200702,含量 100%),單硝酸異山梨酯對照品(批號100694-200401):由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;空白人血漿:由第二炮兵總醫(yī)院血液科提供。

2 溶液的配制

儲備液:精密稱取10.00 mg替米沙坦對照品,置于25 mL量瓶中,加入甲醇溶解,并稀釋至刻度,配制成0.40 g/L替米沙坦儲備液。精密稱取10.00 mg氫氯噻嗪對照品,置于25 mL量瓶中,加入甲醇溶解,并稀釋至刻度,配制成0.40 g/L氫氯噻嗪儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液:分別取1 mL替米沙坦儲備液和0.2 mL氫氯噻嗪儲備液,用乙腈稀釋至4 mL,配制成含100 mg/L替米沙坦和20 mg/L氫氯噻嗪的母液。分別取適量替米沙坦氫氯噻嗪混合母液,用乙腈稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的濃度,替米沙坦的濃度分別為 10.0、30.0、100.0、300.0、1 000.0、3 000.0、10 000.0μg/L,氫氯噻嗪的濃度分別為 2.0(定性考察)、6.0、20.0、60.0、200.0、600.0、2 000.0μg/L。分別取適量替米沙坦氫氯噻嗪混合母液,用乙腈稀釋至質(zhì)控樣本所需的濃度,替米沙坦和氫氯噻嗪的濃度分別為 100.0、1 000.0、8 000.0μg/L 和 20.0、200.0、1 600.0μg/L 。

內(nèi)標(biāo):精密稱取10.00 mg單硝酸異山梨酯對照品,置于100 mL容量瓶中,加入乙腈溶解,并稀釋至刻度,配制成0.1 g/L儲備液。取適量單硝酸異山梨酯儲備液,用乙腈稀釋至濃度為10.0 mg/L。

3 實驗條件

3.1 色譜條件

色譜柱:Zorbax Eclipse XDB-C 18柱(150 mm×4.6 mm×5μm);流動相:乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液;梯度洗脫,梯度條件列于表1;流速1 200μL/min,分流比 1∶1;柱溫 30 ℃;進(jìn)樣量25μL。

表1 梯度條件Table 1 The conditions of gradient elution

3.2 質(zhì)譜條件

離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:-4 500 V;離子源溫度:550 ℃;源內(nèi)氣體1(GS1,N2)壓力:345 kPa;氣體 2(GS2,N2)壓力:449 kPa;氣簾氣體(N2)壓力:138 kPa;掃描方式:多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM);碰撞氣(N2)壓力:Medium;替米沙坦、氫氯噻嗪、單硝酸異山梨酯解簇電壓(DP)分別為-75、-48和-20 V;碰撞能量(CE)分別為 -30、-26和-20 eV;替米沙坦、氫氯噻嗪、單硝酸異山梨酯用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z513.3→469.5、m/z296.9→270.1和m/z190.1→62.0。

3.3 血漿樣品處理

向10 mL EP管中加入500μL血漿樣本,50μL內(nèi)標(biāo)單硝酸異山梨酯和50μL乙腈,振搖3次混勻。加入 3 mL提取試劑V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液,渦流 1 min,振搖10 min,3 500 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一玻璃試管中,35℃氮?dú)饬飨麓蹈?200 μL流動相復(fù)溶,進(jìn)樣25μL,LC-MS/MS分析。

4 分析方法確證

4.1 質(zhì)譜分析

將替米沙坦、氫氯噻嗪和單硝酸異山梨酯貯備液用乙腈稀釋至一定濃度,采用蠕動泵模式進(jìn)樣,按3.2項操作,進(jìn)行碎片離子分析,相應(yīng)的二級全掃描質(zhì)譜圖示于圖1。

圖1 替米沙坦(a)、氫氯噻嗪(b)和內(nèi)標(biāo)單硝酸異山梨酯(c)的[M-H]-二級全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full-scan product ion spectra of[M-H]-for telmisartan(a),hydrochlorothiazide(b)and internal standard isosorbide mononitrate(c)

4.2 方法的專屬性

取6名受試者的500μL空白血漿,分別按3.3項操作,進(jìn)樣25μL,得色譜圖2a;將一定濃度的替米沙坦、氫氯噻嗪和單硝酸異山梨酯溶液加入空白血漿中,按3.3操作,得色譜圖2b和2c;取受試者給藥后收集的血漿樣品,按3.3操作,得色譜圖2d。結(jié)果表明,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾替米沙坦、氫氯噻嗪和單硝酸異山梨酯的測定。

圖2 LC-MS/MS法測定人血漿中替米沙坦(Ⅰ)、氫氯噻嗪(Ⅱ)和內(nèi)標(biāo)單硝酸異山梨酯(Ⅲ)的典型MRM色譜圖Fig.2 Chromatograms of telmisartan(Ⅰ),hydrochlorothiazide(Ⅱ)and internal standard isosorbide mononitrate(Ⅲ)

4.3 線性關(guān)系考察

向10 mL EP管中加入500μL空白血漿樣本,50μL內(nèi)標(biāo)單硝酸異山梨酯,50μL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(替米沙坦和氫氯噻嗪相對于血漿藥物濃度分別為 1.0、3.0、10.0、30.0、100.0、300.0、1 000.0μg/L和 0.2(定性考察)、0.6、2.0、6.0、20.0、60.0、200.0μg/L),振搖 3 次混勻 ,加入 3 mL提取試劑V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液,渦流1 min,振搖10 min,3 500 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一玻璃試管中,35℃氮?dú)饬飨麓蹈?200μL流動相復(fù)溶,進(jìn)樣25 μL,LC-MS/MS分析。每濃度3樣本,連續(xù)測定3天,以血漿中待測物濃度為橫坐標(biāo),待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得回歸方程,即標(biāo)準(zhǔn)曲線。替米沙坦典型的回歸方程為y=0.008 87x+0.004 76(r=0.997 5),氫氯噻嗪典型的回歸方程為y=0.009 00x+0.001 28(r=0.996 7)。替米沙坦線性范圍為1.0～1 000.0 μg/L,氫氯噻嗪線性范圍為0.6～200.0μg/L。

4.4 準(zhǔn)確度與精密度

按2項操作,制備低、中、高3個濃度(替米沙坦和氫氯噻嗪相對于血漿藥物濃度分別為10.0、100.0、800.0μg/L 和 2.0、20.0、160.0 μg/L)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每濃度6樣本,連續(xù)測定3天。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線,計算QC樣品的測得濃度,根據(jù)QC樣品結(jié)果計算該方法的準(zhǔn)確度與精密度,結(jié)果列于表2和表3。結(jié)果顯示,日間、日內(nèi)變異均小于 15%,相對偏差為-4.5%～4.6%,精密度和準(zhǔn)確度均較高,重現(xiàn)性較好。

表2 LC-MS/MS法測定血漿中替米沙坦的準(zhǔn)確度與精密度(n=18)Table 2 The precision and accuracy of telmisartan in human plasma by LC-MS/MS

表3 LC-MS/MS法測定血漿中氫氯噻嗪的準(zhǔn)確度與精密度(n=18)Table 3 The precision and accuracy of hydrochlorothiazide in human plasma by LC-MS/MS

4.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

取500μL空白血漿,按2項操作,制備低、中、高3個濃度樣品(替米沙坦和氫氯噻嗪相對于血漿藥物濃度分別為 10.0、100.0、800.0 μg/L和 2.0、20.0、160.0μg/L)的質(zhì)量控制 ,每濃度3樣本。同時另取500μL空白血漿,加入3 mL提取試劑V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液,渦流1 min,振搖10 min,3 500 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一玻璃試管中,向上清液中加入50μL相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,50 μL內(nèi)標(biāo),渦流混勻,35℃氮?dú)饬飨麓蹈?200μL流動相復(fù)溶,進(jìn)樣25μL,LC-MS/MS分析。獲得相應(yīng)的峰面積,以每一濃度兩種處理方法的測得濃度比值計算提取回收率,替米沙坦和氫氯噻嗪的低、中、高 3個濃度提取回收率分別為:(75.1±2.8)%、(75.9±3.9)%、(73.9±7.3)%和(51.5±2.8)%、(56.6±3.9)%、(56.45±5.9)%,內(nèi)標(biāo)提取回收率為(76.4±3.5)%。試驗對替米沙坦、氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)司的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察,以水代替空白血漿制備低、中、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)考察樣本,以質(zhì)控樣本檢測濃度對基質(zhì)效應(yīng)樣本檢測濃度,計算相對偏差,相對偏差均小于10%,表明血漿無明顯基質(zhì)效應(yīng)存在。

4.6 穩(wěn)定性考察

分別進(jìn)行長期(冰凍放置20 d)、3次凍融和室溫放置3種穩(wěn)定性的考察,將穩(wěn)定性放置后和凍融后的測定結(jié)果與理論濃度進(jìn)行比較,結(jié)果列于表4和表5。結(jié)果顯示,所有穩(wěn)定性試驗中,測定值與添加值的相對偏差均小于10%,表明長期冰凍放置血漿樣品,血漿樣品反復(fù)凍融,以及分析測試過程中樣品較為穩(wěn)定,各種貯存條件不影響本方法對樣品濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測定。

4.7 方法學(xué)應(yīng)用

各10名(男女各5人)健康受試者,分別口服1粒替米沙坦氫氯噻嗪膠囊(含替米沙坦40 mg,氫氯噻嗪12.5 mg),平均血藥濃度-時間曲線示于圖3。

表4 LC-MS/MS法測定替米沙坦的3種穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 4 Results of stabilities of telmisartan in human plasma by LC-MS/MS

表5 LC-MS/MS法測定氫氯噻嗪的3種穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 5 Results of stabilities of hydrochlorothiazide in human plasma by LC-MS/MS

圖3 10名健康受試者口服1粒替米沙坦氫氯噻嗪膠囊后,替米沙坦(a)和氫氯噻嗪(b)的平均血藥濃度-時間曲線Fig.3 Mean plasma concentration versus time curves for telmisartan(a)and hydrochlorothiazide(b)in 10 healthy volunteers

5 討論

用LC-MS/MS法測定血藥濃度具有選擇性好、靈敏度高、分析時間短等優(yōu)點,已普遍地應(yīng)用于藥物動力學(xué)研究。替米沙坦和氫氯噻嗪在人體血漿中濃度較低,且氫氯噻嗪不容易正離子化。本研究發(fā)現(xiàn),替米沙坦在正離子和負(fù)離子化下均有較高的響應(yīng),氫氯噻嗪在負(fù)離子條件下的信號較高,氫氯噻嗪的平均相對分子質(zhì)量297.739 8,最大峰度相對分子質(zhì)量296.964 5,在進(jìn)行氫氯噻嗪[M-H]-分子離子峰掃描時發(fā)現(xiàn),m/z296.9響應(yīng)最高,推測原因為氫氯噻嗪分子中含有2個S,S有較高的同位素峰分布,在低分辨率模式下的掃描范圍為(296.9±0.7)u,同時可以兼顧最大峰度分子質(zhì)量和同位素分子質(zhì)量,因此選用響應(yīng)最高的m/z296.9為氫氯噻嗪分子離子峰,信號較高的碎片離子m/z270.1為子離子。本研究所選色譜柱的孔徑和內(nèi)徑均較大,可以達(dá)到較高的流速,由于質(zhì)譜中的不同化合物并不需要完全的基線分離,采用較陡的梯度,未用酸或堿調(diào)節(jié)水相p H值,替米沙坦、氫氯噻嗪及內(nèi)標(biāo)單硝酸異山梨酯出峰窄而尖,保留時間比較接近,峰寬僅0.20 min,總分析時間5.0 min。流動相中加入乙酸銨可提高質(zhì)譜離子化效率,從而提高信噪比,實驗發(fā)現(xiàn),在5 mmol/L乙酸銨濃度下信號最好。在梯度洗脫條件下,內(nèi)標(biāo)的選擇相對來說比較容易,選用本研究室現(xiàn)有的對照品曲馬多、司可巴比妥、單硝酸異山梨酯等進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)單硝酸異山梨酯負(fù)離子化響應(yīng)較高且比較穩(wěn)定,液相行為與替米沙坦和氫氯噻嗪比較一致,且峰型較好。常見的樣品前處理方案有液-液萃取法、固相萃取法和沉淀蛋白法等,固相萃取法成本較高,蛋白沉淀的方法會帶入較多污染,液-液萃取法比沉淀蛋白處理繁瑣,但樣本前處理過程中對樣本有富集的作用。本實驗為提高氫氯噻嗪的檢測靈敏度,選用液-液萃取法。常用的液-液萃取溶劑有乙醚、二氯甲烷、異丙醇、乙酸乙酯以及V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液、V(正已烷)∶V(二氯甲烷):V(異丙醇)=300∶150∶15的溶液、V(乙酸乙酯)∶V(異丙醇)=95∶5的溶液等混合提取試劑。試驗中,V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液提取回收率較好且穩(wěn)定,可以避免乙酸乙酯、異丙醇提取后復(fù)雜基質(zhì)的影響。本研究所建立的檢測方法中,替米沙坦和氫氯噻嗪的定量下限均能夠檢出達(dá)峰濃度的1/20或5個消除半衰期時的濃度,符合體內(nèi)藥代動力學(xué)的要求。由于替米沙坦在人體呈劑量非線性動力學(xué)特點,隨著給藥劑量的增加,體內(nèi)濃度成倍升高,氫氯噻嗪呈劑量線性動力學(xué)特點。本研究建立的替米沙坦的線性范圍為1.0～1 000μg/L,氫氯噻嗪的線性范圍為0.6～200μg/L,考慮到了后續(xù)更高劑量研究的需要。

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Determination of Telmisartan and Hydrochlorothiazide in Human Plasma by HPLC-MS/MS

MA Ping1,LI Peng-fei1,LIU Li-hong1,WANG Shu-min2,DING Chun-lei1
(1.Pharmacy Department of the Second A rtillery General Hospital,Beijing100088,China;2.Beijing Tongren Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing100730,China)

Telmisartan and hydrochlorothiazide in human plasma were determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Telmisartan,hydrochlorothiazide and the internal standard were extracted from plasma usingV(diethyl ether)∶V(dichloromethane)=60∶40,and separated on a Zorbax Eclipse XDBC 18 column using acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase by gradient elu tion.Detection was carried out by multiple reaction monitoring(MRM)on a 3200Q-Trap LC-MS/MS system.The assay is linear over the range 1.0—1 000.0μg/L with a lower limit of quantitation of 5.0μg/L for telmisartan,and linear over the range 0.6—200.0 μg/L with a lower limit of quantitation of 0.6μg/L for hydrochlorothiazide.Intra-and inter-day precision are less than 15%.The relative deviations are in the range of-5.6%—4.3%for telmisartan,and -6.3%—2.7%for hydrochlorothiazide.The recoveries of telmisartan and hydrochlorothiazide are more than 50%,and stabilities are good.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLCMS/MS);telmisartan;hydrochlorothiazide;pharmacokinetics

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0043-07

2010-03-03;

2010-05-30

馬 萍(1969～),女(漢族),甘肅天水人,副主任藥師。E-mail:maping691009@126.com

李鵬飛(1980～),男(漢族),陜西眉縣人,主任藥師。E-mail:lee-pf@163.com