王洪允,江 驥,胡 蓓

(中國醫(yī)學科學院,北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心,北京 100730)

串聯(lián)質譜在新生兒遺傳代謝性疾病篩查中的應用

王洪允,江 驥,胡 蓓

(中國醫(yī)學科學院,北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心,北京 100730)

遺傳代謝性疾病是一類由于單基因缺陷而引起代謝途徑阻斷的疾病。許多遺傳代謝性疾病對新生兒危害極大,因此是新生兒篩查的主要內容。串聯(lián)質譜用于新生兒篩查是自 Guthrie將細菌抑制法用于苯丙酮尿癥篩查以來,新生兒篩查史上最重要的技術革新。近年來,串聯(lián)質譜已成為新生兒遺傳代謝性疾病篩查中最具發(fā)展?jié)摿Φ摹俺枴奔夹g。本文介紹串聯(lián)質譜在新生兒遺傳代謝性疾病篩查中的技術優(yōu)勢、應用原理和篩查疾病種類,并分析該技術在此領域中的發(fā)展趨勢。

串聯(lián)質譜;遺傳代謝性疾病;新生兒篩查

遺傳代謝性疾病(inherited metabolic diseases,IMD)是指由于基因突變引起酶缺陷、細胞膜功能異?；蚴荏w缺陷,從而導致機體生化代謝紊亂,造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏而引起一系列臨床癥狀的一組疾病[1],迄今發(fā)現(xiàn)的疾病已經(jīng)超過1 000種[2]。雖然IMD單一病種發(fā)病率較低,每種疾病均屬少見病或罕見病,但因病種繁多,綜合患病率并不低。IMD的臨床表現(xiàn)復雜多樣,隨年齡、性別不同而有差異,危害極大。有些疾病在新生兒早期,例如出生后數(shù)小時或幾天內即會發(fā)病,部分疾病卻可能在幼兒期、兒童期、青少年期甚至成年期發(fā)病。由此造成的后果是:一方面,臨床診斷十分困難;另一方面,如果不及早發(fā)現(xiàn)并治療,疾病可對新生兒造成不可逆轉的嚴重損害,如智力低下、終身殘疾,甚至死亡。因此,對 IMD應致力于早期診斷和及時治療,從而避免或減輕疾病的危害。自20世紀60年代 Guthrie等[3]首先采用細菌抑制法篩查苯丙酮尿癥(PKU)以來,世界各主要國家均已在不同程度上開展了新生兒遺傳代謝性疾病的篩查工作。目前,我國主要篩查的項目是先天性甲狀腺功能低下和苯丙酮尿癥[4]。然而,在很長時間內,傳統(tǒng)的IMD篩查方法(如 Guthrie細菌抑制法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附實驗等)都屬于“一種實驗檢測一種疾病”,費用高、周期長,不適用于多種疾病的群體篩查。期間,雖然 GC/MS、HPLC等方法的應用在一定程度上解決了這一技術難題,但仍無法滿足大規(guī)模IMD疾病篩查的要求。

自1990年Millington等[5]首次將串聯(lián)質譜用于新生兒篩查以來,在20年的時間里,串聯(lián)質譜已經(jīng)發(fā)展成為IMD篩查中最理想的分析技術。串聯(lián)質譜是一種高靈敏度、高特異性的快速分析技術,可以同時測定生物樣品中多種目標代謝物,通過一次實驗即可篩查出包括氨基酸、有機酸代謝紊亂、脂肪酸氧化缺陷在內的多種遺傳代謝性疾病,真正實現(xiàn)了從“一種實驗檢測一種疾病”到“一種實驗檢測多種疾病”的轉變,并且能夠使假陽性和假陰性的發(fā)生率大大降低。目前,歐、美、澳洲、新加坡及中國臺灣地區(qū)都已經(jīng)普及串聯(lián)質譜新生兒疾病篩查方案。本文將回顧近年來串聯(lián)質譜在IMD篩查中的研究結果,綜述串聯(lián)質譜在氨基酸、有機酸和脂肪酸氧化缺陷等疾病篩查中的應用原理和技術路線,并分析該技術在IMD篩查中的發(fā)展趨勢。

1 串聯(lián)質譜在新生兒 IMD篩查中的技術路線

1.1 樣品準備

新生兒IMD篩查中最常用的樣品是血液。血樣采集是新生兒疾病篩查流程中最重要的技術環(huán)節(jié)之一,采血質量直接影響實驗結果。干血滴濾紙片法(dry blood spot,DBS)是目前最成熟的血樣采集方法,即由經(jīng)過培訓的醫(yī)護人員用采血針刺新生兒足跟后,以濾紙片收集血滴并進行干燥處理。在此過程中,首先需要考慮的問題是采樣時間。目前,普遍認為新生兒血樣采集的最佳時間應為出生后48～72 h。如果使用48 h以前的血樣,由于許多代謝標志物在體內的含量還沒有達到一定水平,由此會增加假陰性率的發(fā)生[6]。血樣采集后,應該立即置于合適的儲存或運輸環(huán)境中。例如,血中蛋氨酸在室溫條件保存一周后幾乎完全從樣品中消失;乙酰肉毒堿也存在一定程度的降解情況[7]。此外,在應用DBS采集血樣時,濾紙的類型、如何用濾紙收集血滴以及血片是否干燥也會影響血樣采集的質量。

經(jīng)典的干血片樣品處理方法是Millngton等[5]提出的,即將濾紙片打孔后取出,加入甲醇溶解的內標,用甲醇提取,提取液以氮氣完全揮干后加入鹽酸-正丁醇試劑,在加熱條件下密閉反應以生成丁酯衍生物,再以氮氣吹至完全揮干,最后用V(乙腈)∶V(水)=1∶1復溶。需要指出的是,衍生化過程可能會導致某些代謝物或內標的降解,如谷氨酰胺脫氨基轉化為谷氨酸[7]。因此,在研究中應該根據(jù)實際情況對反應溫度、時間和試劑種類進行優(yōu)化。

1.2 內標的選擇

穩(wěn)定同位素內標是進行串聯(lián)質譜分析時最理想的內標,如2H、13C或15N標記-目標代謝物。標記位置應定在目標分子較穩(wěn)定的區(qū)域,同時也應避免同位素內標之間的相互干擾。例如,在酪氨酸分析中,使用13C6-酪氨酸為內標比以2H4-酪氨酸更為穩(wěn)定,因為后者由于氘的置換作用會導致樣品中酪氨酸含量被高估;又例如,由于乙酰肉毒堿在溶液或樣品制備過程中會發(fā)生水解,因此標記位置不應是N-甲基,而應在碳鏈骨架上[8]。

1.3 串聯(lián)質譜分析

質譜是根據(jù)樣品離子的質量電荷比來進行定性和定量研究的一種分析技術。串聯(lián)質譜是將2個以上的質譜串聯(lián)在一起形成的多級質譜,如四極桿-四極桿質譜、磁質譜-四極桿質譜、四極桿-飛行時間質譜等。這些質譜是由2個以上的質譜在空間上實現(xiàn)串聯(lián),故又可稱為空間串聯(lián)質譜。而離子阱、傅里葉回旋共振等質譜由于工作原理的特殊性,不需要與其他質量分析器串聯(lián),自身即可進行質譜-質譜操作,因此對應的被稱為時間序列串聯(lián)質譜。其中,由2個四極桿質量分析器經(jīng)1個碰撞室串聯(lián)而成的串聯(lián)四極桿質譜是在IMD篩查中最常用的質譜儀。串聯(lián)四極桿質譜在測定樣品時,樣品首先在離子源中被離子化,隨即通過第一級質譜(MS1)選擇一定質荷比的離子使其進入碰撞室,與室內的碰撞氣(常用的氣體為 He、Ar、N2、CH4等)進行碰撞誘導裂解產(chǎn)生碎片離子,再由第二級質譜(MS2)根據(jù)質荷比對碎片離子進行選擇分析。

串聯(lián)質譜有4種主要的掃描方式:子離子掃描、母離子掃描、中性丟失掃描和多反應離子監(jiān)測,IMD篩查常采用后3種掃描方式。在進行母離子掃描時,MS2選擇特征碎片離子,MS1線性掃描并獲得所有能夠產(chǎn)生這一碎片離子的母離子;在進行中性丟失掃描時,MS1和MS2同時進行線性掃描,但始終保持恒定的質量差(Δm),最終獲得可以產(chǎn)生該中性碎片(Δm)的所有離子;在進行多反應離子監(jiān)測時,MS1和MS2選擇性檢測特定母-子離子對。以串聯(lián)質譜進行IMD篩查時,可以采用單一功能掃描,也可以將幾種掃描方式結合使用。例如,中性丟失掃描(Δm=102 u)可用于篩查部分酸性和中性氨基酸;母離子掃描(碎片離子m/z85)用于篩查?；舛緣A。但如果需要同時對氨基酸代謝紊亂和脂肪酸氧化缺陷進行篩查時,較理想的分析方式是將中性丟失掃描、母離子掃描與多反應離子監(jiān)測整合使用,即從多渠道獲得質譜數(shù)據(jù)以保證篩查結果的準確性。

1.4 方法考核

串聯(lián)質譜技術的特點是大大降低了篩查診斷的假陰性和假陽性,這得益于串聯(lián)質譜在特異性和靈敏度等方面的技術優(yōu)勢,而方法學考核是確保這些技術優(yōu)勢能夠應用于實際工作的有效途徑。基于疾病篩查的特殊性進行方法建立和考核時,不妨從以下兩方面加以考慮:1)分析方法考核。重點考察方法的特異性、重復性、精密度和準確度。2)方法驗證。方法建立并通過考核后,可取一定數(shù)量已知結果的陽性和陰性樣本,編盲后以串聯(lián)質譜方法進行分析,然后開盲驗證串聯(lián)質譜篩查結果。此外,還可以通過實驗室之間的比對考核以驗證篩查的準確性。

1.5 串聯(lián)質譜結果處理

借助于質譜儀的數(shù)據(jù)處理軟件,獲得的串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)可以是目標代謝物的絕對濃度,也可以是代謝物與內標或幾種關聯(lián)代謝物之間的離子峰豐度比。問題的關鍵是如何將代謝物的測定數(shù)據(jù)轉換成有意義的臨床結果,因為數(shù)據(jù)處理方法對結果分析有很大影響。例如,在中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(MCAD)中,由于代謝酶的缺乏,患者血中 C8-?；舛緣A異常升高,然而若僅依據(jù)C8-酰基肉毒堿濃度進行篩查,結果的準確性明顯劣于C8-?；舛緣A/C0-游離肉毒堿或C8-/C2-?；舛緣A的比值[9-10];又例如,在苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)中,由于患者體內苯丙酸羥化酶的缺乏,苯丙氨酸(Phe)不能正常代謝為酪氨酸(Tyr),隨著時間的推移,苯丙氨酸不斷蓄積,而酪氨酸持續(xù)減少(飲食中的攝入不足以維持其水平),因此,與 Phe濃度相比,采用 Phe/Tyr比值作為篩查指標會更加靈敏,減少假陰性率[11]。此外,在分析串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)時,還應該考慮到體內某些代謝物的異常變化可能源于不同疾病,例如,血中 Phe和 C8-?；舛緣A的異常升高除了PKU和MCAD所致外,還可見于丙酸血癥和甲基丙二酸尿癥中。因此,在分析串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)時,必須結合臨床癥狀以及其他檢驗結果,并注意排除其他疾病的干擾,以保證篩查結果的準確性。

2 串聯(lián)質譜在IMD篩查中的應用

IMD是一類以功能障礙為主要表現(xiàn)的遺傳性缺陷疾病,它涉及氨基酸、有機酸、脂肪酸、尿素循環(huán)、碳水化合物、類固醇、維生素等多種物質的代謝異常,可導致多個系統(tǒng)受損。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳科學院(The American College of Medical Genetics,ACMG)頒布的新生兒篩查指南[12],在54種需要篩查的 IMD疾病中,有38種可以采用串聯(lián)質譜方法分析,其中18種屬于首要篩查項目,20種屬于次級篩查項目,分別列于表1和表2[13]。所涉及的IMD疾病種類包括氨基酸代謝紊亂,有機酸癥,脂肪酸氧化缺陷(?；舛緣A缺乏)和尿素循環(huán)缺陷等。

表1 在ACMG新生兒篩查指南中,能夠應用串聯(lián)質譜分析的首要篩查項目Table 1 Core disorders in ACMGguideline which could be screened via tandem mass spectrometry

表2 在ACMG新生兒篩查指南中,能夠應用串聯(lián)質譜分析的次級篩查項目Table 2 Secondary disorders in ACMGguideline which could be screened via tandem mass spectrometry

2.1 氨基酸代謝紊亂

新生兒的氨基酸代謝異常多數(shù)是由于氨基酸代謝途徑中某些關鍵酶的缺乏導致相應的氨基酸不能進行代謝,體內濃度出現(xiàn)異常。例如,PKU是比較常見的氨基酸代謝異常疾病,病因在于患者肝內缺乏苯丙氨酸羥化酶,使苯丙氨酸不能正常代謝為酪氨酸,因此,大量的苯丙氨酸及苯丙酮酸蓄積于體內,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害,嚴重時會導致新生兒智力發(fā)育遲滯。PKU是我國新生兒篩查中的必檢項目。

目前,根據(jù)ACMG的新生兒篩查指導原則,串聯(lián)質譜可以篩查的氨基酸類代謝疾病有苯丙酮尿癥、楓糖尿癥、酪氨酸血癥I型和II型、同型半胱氨酸尿癥等10種[12-13]。經(jīng)典的篩查方法需要對樣品進行衍生化,目的在于提高離子化效率和產(chǎn)生特定碎片離子。最常用的衍生化方法是以正丁醇在酸性條件下與氨基酸的羧基發(fā)生反應,形成丁基酯衍生物。在串聯(lián)質譜碰撞誘導解離作用下,多數(shù)α-酸性、中性氨基酸產(chǎn)生102 u(丁基甲酯)的中性碎片丟失,少數(shù)氨基酸產(chǎn)生56 u(甘氨酸)和161 u(精氨酸)中性碎片丟失。此外,部分側鏈含有堿性基團的氨基酸(如賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天門冬酰胺等)能夠產(chǎn)生119 u中性丟失[14]。根據(jù)這些質譜信息,可以采用中性丟失掃描或/和多反應離子監(jiān)測,建立半定量或絕對定量的串聯(lián)質譜分析方法進行氨基酸類代謝疾病的篩查。

2.2 脂肪酸氧化缺陷

脂肪酸在線粒體內的β氧化是人體能量的主要來源。長鏈脂肪酸首先在細胞質中活化成長鏈脂酰CoA,然后以肉毒堿作為載體(形成?；舛緣A)進入線粒體;進入線粒體后,隨即釋放出游離肉毒堿和長鏈脂酰CoA;后者在線粒體的各種酶作用下,經(jīng)脫氫、加水、再脫氫和硫解4個步驟逐步分解為中鏈和短鏈脂酰CoA,依次進入β氧化的下一個循環(huán)。因此,以上各步驟中任何一種酶的缺乏都會導致脂肪酸氧化缺陷,而體內游離肉毒堿和各對應酰基肉毒堿的濃度變化可以反應脂肪酸代謝的狀況。串聯(lián)質譜對此類疾病的篩查是通過測定體內游離肉毒堿和各?；舛緣A的濃度來判定是否存在代謝異常。

串聯(lián)質譜測定肉毒堿時可采用與分析氨基酸一樣的衍生化方法,但因其結構與氨基酸不同,各種肉毒堿經(jīng)碰撞誘導解離后產(chǎn)生的是85 u特征碎片離子。因此,可以采用母離子掃描或/和多反應離子監(jiān)測,建立半定量或絕對定量的串聯(lián)質譜分析方法進行篩查。目前,串聯(lián)質譜方法已經(jīng)成為脂肪酸氧化缺陷篩查中最可靠的分析方法,應用于長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏、肉堿棕櫚油酰合成酶缺乏等多種疾病的篩查。本實驗室采用液相色譜-串聯(lián)質譜技術建立了微量血標本中游離肉毒堿及多種?；舛緣A半定量及定量分析方法,該方法以C7-和C11-?；舛緣A為內標,母離子掃描(碎片離子85 u)和選擇離子監(jiān)測分別對游離肉毒堿、C2-、C4-、C5-、C10-和C12-酰基肉毒堿進行半定量和絕對定量,可以用于新生兒篩查[15]。在美國,法定進行新生兒氨基酸、游離肉毒堿和?；舛緣A代謝缺陷的篩查,為此,美國 FDA在2004年正式頒布了串聯(lián)質譜法在新生兒篩查中應用的專門指導原則[16]。

2.3 有機酸代謝性疾病

有機酸是氨基酸、脂肪、糖中間代謝過程中所產(chǎn)生的羧酸,有機酸血(尿)癥是由于某種酶的缺陷導致相關羧酸及其代謝產(chǎn)物的蓄積而引發(fā)的遺傳代謝性疾病。由于部分有機酸代謝途徑比較類似,具有相同的代謝標志物,因此給篩查診斷帶來了挑戰(zhàn)。例如,丙酸尿癥(propionic academia,PA)表現(xiàn)在新生兒體內C3-?；舛緣A濃度異常高,即游離肉毒堿濃度在出生后幾天內迅速降低。因此,串聯(lián)質譜篩查PA的關鍵在于對C3-酰基肉毒堿和游離,C2-、C16-?；舛緣A快速而準確的測定。甲基丙二酸尿癥(methylmalonicaciduria,NMA)是另一種比較常見的有機酸類疾病,靶點同樣是C3-酰基肉毒堿以及游離,C2-、C16-酰基肉毒堿。因此,盡管 PA中C3-酰基肉毒堿濃度值要高于NMA,但由于個體間的高變異,僅依據(jù)C3-?；舛緣A濃度值很難區(qū)分這兩種疾病。Chase等[16]對所在實驗室近10年的數(shù)據(jù)進行分析,通過嘗試不同代謝物比值和C3-?；舛緣A的臨界值,認為在C3-酰基肉毒堿濃度的基礎上,結合C3/C2比值可以更有效的進行PA和NMA篩查[17]。

2.4 溶酶體貯積癥

溶酶體是一種細胞器,其內部含有60多種酸性水解酶,可降解各種生物大分子,如核酸、蛋白質、脂質、粘多糖及糖原等。當溶酶體酶出現(xiàn)缺陷時,就會導致特定生物大分子不能正常降解而在溶酶體中貯積,從而使得溶酶體發(fā)生腫脹,細胞變得臃腫失常,細胞功能受到嚴重影響,最終導致一系列疾病,統(tǒng)稱為溶酶體貯積癥(lysosomal storage disorders,LSDs)。溶酶體酶缺陷的直接原因是編碼酶的基因發(fā)生突變,故大多數(shù)LSDs為常染色體隱性遺傳。

雖然每一種LSDs均較少見,但作為一組疾病而言,其患病率在活產(chǎn)嬰兒中達l/7 700,在美洲、歐洲及澳洲,LSDs發(fā)生率約為新生嬰兒的1/5 000～1/8 000,美國每年約有500～800名LSDs患兒出生,給社會造成極大負擔。迄今我國尚無LSDs確切患病率的統(tǒng)計學資料,但兒科診斷的LSDs日益增多?；谫A積物的復雜性及其組織分布與聚積速度的不同,LSDs既可導致多種器官系統(tǒng)的病變,也可僅局限于神經(jīng)系統(tǒng),并且自出生至成年期均可發(fā)病。目前,LSDs的診斷主要通過測定溶酶體酶活性及鑒定特殊貯積產(chǎn)物。國外已有將串聯(lián)質譜應用于溶酶體貯積癥的篩查,診斷以及治療監(jiān)測[18],在診斷速度、樣品用量、靈敏性和特異性上均比傳統(tǒng)的酶學測定有了很大的提高。

3 串聯(lián)質譜在新生兒 IMD篩查中的發(fā)展趨勢

自Millington將串聯(lián)質譜技術引入新生兒IMD篩查領域以來,液相色譜-串聯(lián)質譜(LCMS/MS)成為IMD篩查中最成熟的質譜技術。LC-MS/MS以色譜實現(xiàn)分離,串聯(lián)質譜進行檢測,具有分離和結構解析同步完成的特點,能快速定量和定性分析復雜生物基質中多種痕量組分。在IMD疾病篩查中,LC-MS/MS的“標準”設置是LC-ESI-串聯(lián)四極桿質譜。近年來,隨著超高效液相色譜(UPLC)和大氣壓光離子電離(APPI)等多種新技術的不斷出現(xiàn),LC-MS/MS在分離能力、檢測靈敏度及適用范圍方面得以進一步改善。可以預見,在今后的研究中,基于串聯(lián)質譜技術的疾病篩查譜一定會得以擴展。事實上,雖然ACMG僅列出38種可以采用串聯(lián)質譜進行篩查的代謝性疾病,但從分析的角度,目前至少有超過80種疾病可以歸入這種技術的篩查體系[13]。那么,采用串聯(lián)質譜技術進行疾病篩查需要滿足哪些條件呢?我們認為這首先取決于以下兩個標準:1)特異性。與常規(guī)的免疫等方法相比,對于目標疾病,串聯(lián)質譜是否能夠表現(xiàn)出更好的特異性。2)工作效率和檢測費用。對于多種疾病的代謝標志物,串聯(lián)質譜方法是否能夠成功實現(xiàn)從“一種實驗檢測一種疾病”到“一種實驗檢測多種疾病”的轉變,從而提高篩查效率、降低篩查費用。根據(jù)這兩個基本原則,考慮到近年來串聯(lián)質譜技術的迅速發(fā)展,對于那些與遺傳代謝性疾病有關的諸多小分子化合物,如維生素D和B12、類固醇(17-OHP、雄甾烯二酮、皮質醇)、激素等,以及部分多肽類標志物,LCMS/MS必將成為篩查的核心技術。

盡管串聯(lián)質譜具有較多優(yōu)勢,但并不能完全否定和取代傳統(tǒng)的篩查方法。此外,串聯(lián)質譜在IMD中的應用還有以下困擾:1)質譜儀價格昂貴;2)醫(yī)療單位缺少熟練掌握串聯(lián)質譜技術的專業(yè)人員;3)醫(yī)生對串聯(lián)質譜技術的懷疑和不支持;4)質譜數(shù)據(jù)不能合理轉化為臨床診斷結果;5)不同國家和地區(qū),以及不同種族之間代謝標志物參考值的標準化。

隨著人們對各種遺傳代謝性疾病機理認識的加深,以及串聯(lián)質譜技術的日益成熟,將會有更多的疾病可以通過串聯(lián)質譜進行分析篩查。

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Application of Tandem Mass Spectrometry to Newborn Screening for Inherited Metabolic Diseases

WAN G Hong-yun,J IANGJi,HU Pei
(Clinical Pharmacology Research Center,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing100730,China)

Inherited metabolic diseases are a group of metabolic disorders caused by singe gene defect.Many of these diseases carry serious clinical consequences to neonate or infant and therefore are a major part of newborn screening.The application of tandem mass spectrometry is the most important renovation in the field besides the application of bacterial inhibition assay to the screening of phenylketonuria by Guthrie.Recently,tandem mass spectrometry has revolutionized the field with rapid progress in technology.This paper reviews the advantages,fundamentals and screening diseases of tandem mass spectrometry.Future of this technology in newborn screening for inherited metabolic diseases is also predicted.

tandem mass spectrometry;inherited metabolic diseases;newborn screening

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0024-07

2010-11-19;

2011-01-15

王洪允(1975～),男(滿族),遼寧人,博士,助理研究員,臨床藥理學專業(yè)。E-mail:wanghongyunpharm@yahoo.com

胡 蓓(1956～),女(漢族),四川人,教授,博士生導師,臨床藥理學專業(yè)。E-mail:pei.hu.pumc@gmail.com