李學(xué)遠(yuǎn) 夏 豪 (武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

基質(zhì)金屬蛋白酶-9對斑塊穩(wěn)定性的影響及強(qiáng)力霉素的干預(yù)效果

李學(xué)遠(yuǎn)1夏 豪 (武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)與大鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系及強(qiáng)力霉素的干預(yù)效果。方法 36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組(C組)、動脈粥樣硬化組(A組)和強(qiáng)力霉素干預(yù)組(D組)，A組和D組給予高脂飼料+維生素D3腹腔注射，D組同時予強(qiáng)力霉素10 mg·kg－1·d－1腹腔注射一次。于第14周確定造模成果后測量血清MMP-9、血漿超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平，取主動脈石蠟包埋切片，HE染色，觀察斑塊形態(tài)，計(jì)數(shù)易損斑塊數(shù)目。結(jié)果 D組血MMP-9、hs-CRP水平均低于A組(P＜0.01，P＜0.05)，而高于C組(P＜0.01);各組MMP-9與hs-CRP水平呈正相關(guān)(r=0.928，P＜0.01)。D組血管內(nèi)膜/中膜面積比及易損斑塊計(jì)數(shù)較A組均降低(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論 強(qiáng)力霉素可以通過抑制MMP-9活性達(dá)到穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9;斑塊穩(wěn)定性;強(qiáng)力霉素;C反應(yīng)蛋白

易損斑塊破裂、出血及形成血栓是急性冠脈綜合征發(fā)病的主要機(jī)制〔1〕。研究顯示易損斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)明顯增加，致基質(zhì)膠原合成與降解失衡，降解多于合成〔2〕，是造成斑塊纖維帽變薄，斑塊潰瘍或破裂的重要因素。MMP-9由斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥因子分泌，高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)是反應(yīng)體內(nèi)炎癥活動的敏感性指標(biāo)，目前認(rèn)為MMP-9與hs-CRP聯(lián)合檢測可評價預(yù)測斑塊穩(wěn)定性的指標(biāo)。本文應(yīng)用MMPs抑制劑強(qiáng)力霉素干預(yù)動脈粥樣硬化大鼠MMP-9的活性表達(dá)，并檢測血清MMP-9水平及hs-CRP水平變化，觀察動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)，以探討MMP-9與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系及強(qiáng)力霉素的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、儀器與試劑 健康純種雄性Wistar大鼠36只(SPF級)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重220～260 g。MMP-9 ELISA試劑盒購于TPInIc公司，免疫組化染色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、紫外分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)、電子天平由武漢大學(xué)心血管病學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。強(qiáng)力霉素粉購于Sigma公司，實(shí)驗(yàn)時以0.9%生理鹽水按2∶1比例配成注射液。

1.2 模型建立與分組 36只大鼠隨機(jī)分為對照組(C組)、動脈粥樣硬化組(A組)和強(qiáng)力霉素干預(yù)組(D組)。C組只給予普通飲食，A組和D組每天給予按“3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料”配制的高脂飼料約20 g，飲水不限，喂食開始時腹腔注射維生素D3 70萬IU/kg，分3 d給完，每隔1個月追加一次維生素 D3 30萬/kg。D組在造模同時每天一次腹腔注射強(qiáng)力霉素10 mg/kg，C組和A組給予等劑量0.9%生理鹽水處理。于喂養(yǎng)12 w后處死A組大鼠一只，甲醛固定胸主動脈，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片固定于載玻片上，HE染色，光學(xué)顯微鏡示粥樣硬化的病理特征出現(xiàn)，確定造模成功，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 指標(biāo)測定 于第14周給予3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露心臟，開胸取左心室腔血 2 ml，4℃3 000 r/min離心10 min后取血清，雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測MMP-9水平，采用酶法并用全自動生化分析儀測定血清hs-CRP水平;取升主動脈起始部約2～3 cm左右的動脈段于10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、固定、透明、包埋、切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，應(yīng)用圖像分析儀測量內(nèi)膜、中膜厚度，計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比(I/M)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，行方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血清MMP-9及hs-CRP水平 D組血清MMP-9、hs-CRP水平均明顯低于A組(P＜0.01)，但明顯高于C組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)水平(±s)

表1 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)水平(±s)

與C組比較:1)P＜0.05;與A組比較:2)P＜0.05

組別 n MMP-9(μg/ml) hs-CRP(μg/ml)10 0.57±0.21 518.04±53.98 A組 10 5.16±0.891) 1 436.31±59.911)D組 10 1.59±0.551)2) 924.56±69.311)2)C組

2.2 HE染色結(jié)果 光鏡下觀察，C組主動脈管腔完整光滑，各層結(jié)構(gòu)清晰;A組和D組管腔均明顯變窄，內(nèi)膜明顯增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，A組內(nèi)膜內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，D組可見鈣化斑塊形成。將脂質(zhì)核心大于斑塊40%者判定為易損斑塊，A組易損斑塊數(shù)及斑塊I/M明顯高于D組和C組(P＜0.01)，而 D組與 A組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見表2。

表2 各組易損斑塊數(shù)及I/M比較

3 討論

急性冠脈綜合征的發(fā)生絕大部分是由其斑塊的穩(wěn)定性而非斑塊的大小決定的〔1〕，近來提出的易損斑塊即是指在結(jié)構(gòu)和功能上具有易損性并可能快速進(jìn)展成為罪惡斑塊的那些粥樣硬化病變。本研究根據(jù)Naghavi等〔3〕的標(biāo)準(zhǔn)將脂質(zhì)核心大于斑塊體積40%以上者判定為易損斑塊。MMPs是一類活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶類，主要的生理功能是降解ECM 成分，如膠原、明膠、彈性蛋白等〔4～6〕，MMP-9是其中的一種，即明膠酶B，MMP-9能直接降解內(nèi)皮基質(zhì)，使斑塊纖維帽變薄從而削弱斑塊穩(wěn)定性〔7，8〕。研究表明急性冠脈綜合征患者血清MMP-9水平明顯升高，且證實(shí)是冠脈內(nèi)斑塊破裂釋放入血循環(huán)引起〔9〕。本研究證實(shí)了MMP-9水平與斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)，其水平升高可以作為判定斑塊不穩(wěn)定的血清學(xué)指標(biāo)之一。

強(qiáng)力霉素屬四環(huán)素類抗生素，大劑量時具有抗菌作用，而在小劑量時能螯合金屬離子從而起到抑制MMPs的活性的作用〔10，11〕。本研究以 10 mg·kg－1·d－1的小劑量強(qiáng)力霉素作用與動脈粥樣硬化大鼠模型后，發(fā)現(xiàn)與動脈粥樣硬化組比較，其血脂水平無明顯變化，但血清MMP-9水平明顯降低，穩(wěn)定斑塊數(shù)增加，提示強(qiáng)力霉素可以通過抑制MMP-9的活性而增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，且這一作用與血脂的代謝水平無關(guān)。有研究顯示，MMP-9除能直接降解基質(zhì)降低斑塊纖維帽強(qiáng)度外，還可能參與了斑塊內(nèi)新生血管的生成，而新生血管又可增加斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的侵入，活化的炎性細(xì)胞又可分泌生長因子和釋放MMPs，由此激發(fā)了正反饋機(jī)制，促進(jìn)斑塊的發(fā)生發(fā)展，甚至誘發(fā)斑塊內(nèi)出血和斑塊破裂〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)力霉素雖不能直接抑制MMP-9的合成，但強(qiáng)力霉素組MMP-9水平仍明顯降低，可能與強(qiáng)力霉素抑制了MMP-9的活性后，阻斷上述正反饋機(jī)制有關(guān)。

目前普遍認(rèn)為動脈粥樣硬化是動脈壁對脂質(zhì)沉積的一種炎癥纖維增生性反應(yīng)〔13〕，而hs-CRP被公認(rèn)是反映體內(nèi)炎癥活動的敏感性指標(biāo)，并且可以作為判斷斑塊的穩(wěn)定性的間接指標(biāo)〔14〕。本研究中，強(qiáng)力霉素組血清hs-CRP水平較動脈粥樣硬化組顯著降低，而其易損斑塊數(shù)也明顯降低，這與劉海波〔15〕等通過冠狀動脈造影發(fā)現(xiàn)血清CRP水平與斑塊形態(tài)特征存在正相關(guān)的報(bào)道相一致，表明強(qiáng)力霉素干預(yù)能夠增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，減少斑塊內(nèi)炎癥活動。而強(qiáng)力霉素減少炎癥活動的作用是由于阻斷了上述正反饋機(jī)制，抑或本身即具有抗炎作用所致目前尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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R543.31

A

1005-9202(2011)12-2282-02

1 黃石市第二醫(yī)院

夏 豪(1966-)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事冠心病防治研究。

李學(xué)遠(yuǎn)(1980-)，男，碩士，主要從事心血管疾病的診治研究。

〔2010-06-18收稿 2010-09-20修回〕

(編輯 劉 愉/曹夢園)