李杰茹 韓聚強 張利敏 趙國華 王 剛 (河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 05000)

N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮對血管性癡呆大鼠神經(jīng)的保護作用

李杰茹 韓聚強 張利敏1趙國華2王 剛1(河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050200)

目的 觀察N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮(N-{(2-acetoxyl)benzoyl}-2-pyrrdidone，NABP)對血管性癡呆(VD)大鼠神經(jīng)保護研究及其機制。方法 采用改良的二血管阻斷+硝普鈉法制備VD大鼠模型，術(shù)后隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、NABP 20、10、5 mg/kg和陽性對照藥尼莫地平10 mg/kg組。給藥20 d后，采用HE染色觀察大鼠皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)學變化，流式細胞術(shù)測定兩腦區(qū)的神經(jīng)細胞凋亡百分率，雙波長熒光光度法測定兩腦區(qū)細胞內(nèi)游離鈣離子濃度(〔Ca2+〕i)。結(jié)果 NABP明顯抑制模型大鼠皮層及海馬神經(jīng)細胞的變性壞死，可以降低兩腦區(qū)神經(jīng)細胞凋亡百分率及降低兩腦區(qū)(〔Ca2+〕i)。結(jié)論 NABP具有神經(jīng)保護作用，該作用可能與其降低神經(jīng)細胞內(nèi)鈣，抑制鈣超載有關(guān)。

N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮;血管性癡呆;凋亡;鈣

患者常伴有不同程度的智力障礙，嚴重者不僅影響患者的生存質(zhì)量，而且增加社會和家庭負擔。但目前臨床上尚無有效的治療辦法和控制本病的特效藥物〔1，2〕，因此VD治療藥物的開發(fā)成為新藥研發(fā)的一個熱點。N-〔(2-乙酰氧基)苯甲?；?吡咯烷-2-酮(N-{(2-acetoxyl)benzoyl}-2-pyrrdidone，NABP)為新合成的吡咯烷類衍生物，本文采用雙側(cè)頸總動脈反復夾閉再灌注同時腹腔注射硝普鈉降壓法建立VD大鼠模型，觀察NABP對模型大鼠的神經(jīng)保護作用，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠80只，雌雄各半，體重250～300 g，由河北省實驗動物中心提供，試驗期間飼養(yǎng)于專用飼養(yǎng)籠內(nèi)，每盒2只，自由進食飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器 NABP由河北化工職業(yè)技術(shù)學院王剛副教授惠贈，批號:080612，純度為99.0%;注射用硝普鈉由北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn);尼莫地平片由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:000605;碘化乙碇:Sigma公司;Fluo-star型多功能微分析儀:德國BM公司;FACS420流式細胞儀:美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 按性別、體重將動物隨機分為6組，即假手術(shù)組、模型對照組、NABP(20、10、5 mg/kg)組、陽性對照藥尼莫地平10 mg/kg組。

1.3.2 模型制備〔3〕參照文獻采用雙側(cè)頸總動脈(CAA)反復夾閉再灌注同時腹腔注射硝普鈉降壓法建立血管性癡呆模型。腹腔注射35 mg/kg水合氯醛麻醉大鼠后，仰位固定于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)CCA，在夾閉雙側(cè)CAA之前，模型對照組、NABP處理組和尼莫地平組均腹腔注射硝普鈉2.5 mg/kg，隨即用無創(chuàng)動脈夾夾閉頸總動脈10 min，再通10 min，再夾閉10 min，然后縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組的麻醉及手術(shù)過程與模型組相同，但不阻斷CAA，不注射硝普鈉。

1.3.3 給藥劑量及方式 所有藥物均以蒸餾水配制成混懸液灌胃給予，每天一次，灌胃容積為1 ml/100 g體重，術(shù)后10 d開始，連續(xù)給予20 d，假手術(shù)組和模型對照組每天灌胃給予相量的蒸餾水。

1.3.4 組織病理學檢查 末次給藥后1 h，每組取大鼠5只，斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察大腦皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)。

1.3.5 細胞凋亡的定量分析〔4〕末次給藥后每組取大鼠5只，斷頭取腦，剝離皮層及海馬組織，冷70%乙醇中固定，用機械法分散神經(jīng)細胞，經(jīng)300目銅網(wǎng)過濾，以0.01 mol/L PBS洗滌并制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，碘化乙啶染色，F(xiàn)ACS420流式細胞儀測定，將所得數(shù)據(jù)經(jīng)Bioconsort專用軟件處理，分析細胞的凋亡百分率。

1.3.6 神經(jīng)細胞內(nèi)游離鈣離子濃度(〔Ca2+〕i)的測定〔5〕末次給藥后1 h，取每組剩余5只大鼠，斷頭取腦，剝離皮質(zhì)和海馬組織，分別置于冰冷D-Hank's液中沖洗，于DMEM培養(yǎng)液中剪碎，吸管吹打分散細胞，經(jīng)300目銅網(wǎng)過濾，離心后棄上清，以DEME培養(yǎng)基制成單細胞懸液，臺盼藍排斥試驗檢查，細胞成活率達90%以上。細胞懸液在37℃水浴中預溫5 min，加入5μmol/L的Fura-2/AM避光振蕩40 min進行負載，負載后的細胞以D-Hank's液洗滌，制成1×106個/ml的單細胞懸液，采用Fluo-star型多功能微分析儀，于激發(fā)波長為340和380 nm，發(fā)射波長為505 nm，測定熒光強度，并按文獻公式計算了神經(jīng)細胞〔Ca2+〕i。

2 結(jié)果

2.1 NAPB對血管性癡呆大鼠腦組織形態(tài)學的影響 與假手術(shù)組相比，模型大鼠海馬錐體細胞及皮層細胞大量變性，部分神經(jīng)細胞胞核深染，固縮變形，給予NAPB 20、10 mg/kg或尼莫地平10 mg/kg進行干預，可以明顯改善這種變化。

2.2 NAPB對血管性癡呆大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響 模型對照組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡百分率明顯高于假手術(shù)組，灌胃給予NAPB 20、10 mg/kg或尼莫地平10 mg/kg，細胞凋亡百分率明顯降低，但NAPB 5 mg/kg對細胞凋亡百分率無明顯影響。見表1。

表1 NAPB對VD大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響(±s，n=5)

表1 NAPB對VD大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響(±s，n=5)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型對照組比較:2)P＜0.01

組別 劑量(mg/kg)海馬腦區(qū) 皮層腦區(qū)假手術(shù)組 － 1.6±0.21) 0.5±0.11)模型對照組 － 10.2±0.4 6.9±0.6尼莫地平組 10 7.3±0.51) 4.0±0.62)NABP組 20 5.4±0.92) 3.1±0.52)10 6.9±0.72) 5.2±0.22)5 9.7±0.5 6.7±0.4

2.3 NAPB對血管性癡呆大鼠神經(jīng)細胞〔Ca2+〕i的影響 模型對照組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)〔Ca2+〕i較假手術(shù)組大鼠兩腦區(qū)有明顯升高，給予NAPB 20、10mg/kg或尼莫地平10mg/kg后〔Ca2+〕i明顯降低，NAPB 5mg/kg組大鼠兩腦區(qū)〔Ca2+〕i與模型對照組〔Ca2+〕i相比無明顯變化。見表2。

表2 NAPB對VD大鼠神經(jīng)細胞〔Ca2+〕i的影響(±s，n=5)

表2 NAPB對VD大鼠神經(jīng)細胞〔Ca2+〕i的影響(±s，n=5)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型對照組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 劑量(mg/kg)海馬腦區(qū) 皮層腦假手術(shù)組 － 148±251) 159±371)模型對照組 － 346±48 328±44尼莫地平組 10 248±533) 238±313)NABP組 20 203±422) 199±402)10 246±403) 224±392)324±46 312±51 5

3 討論

VD是由于缺血或出血性腦血管疾病以及全腦缺血缺氧而引起的認知功障礙，主要表現(xiàn)為智能衰退。血管性癡呆引起智能衰退與腦缺血造成的神經(jīng)損傷密切相關(guān)。而神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載則是引起細胞損傷的重要原因〔6〕。鈣離子(Ca2+)是維持神經(jīng)信號傳遞的重要第二信使，細胞內(nèi)Ca2+水平極微小的變化就有可能引起一系列變化。腦缺血后細胞內(nèi)Ca2+濃度異常增高，引起鈣超載，激活鈣依賴性磷脂酶和蛋白酶，引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損害，進一步增加膜對離子的通透性，誘發(fā)神經(jīng)凋亡或壞死〔7〕。本實驗結(jié)果顯示，大鼠造模成功后，其海馬錐體細胞及皮層細胞大量變性，部分神經(jīng)細胞胞核深染，固縮變形，且兩腦區(qū)細胞凋亡百分率明顯升高，而給予NABP干預后，可以逆轉(zhuǎn)這種變化，說明NABP對腦神經(jīng)元具有一定的保護作用。為了進一步探討其神經(jīng)保護作用的可能機制，我們又采定了兩腦區(qū)〔Ca2+〕i，結(jié)果發(fā)現(xiàn) NABP可以降低兩腦區(qū)〔Ca2+〕i，抑制由于腦缺血造成的鈣超載。當然，大量的研究顯示，缺血后機體的抗氧化能力降低也是引起神經(jīng)損傷的原因，NABP在抑制鈣超載的同時，是否具有其他方面作用，有待進一步研究。

1 Roman GC.Vascular dementiamay be themost common form of dementia in the elderly〔J〕.JNeurol Sci，2002;15(203-204):7-10.

2 Kalaria RN，Maestre GE，Arizaga R，etal.Alzheimer's disease and vascular dementia in developing countries:prevalence，management，and risk factors〔J〕.Lancet Neurol，2008;7(9):812-26.

3 王 蕊，楊秦習，唐一鵬，等.大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進〔J〕.中國病理生理雜志，2000;16(10):914-6.

4 左連富.流式細胞樣品制備技術(shù)〔M〕.北京:華夏出版社，1991:14-9.

5 張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法〔M〕.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1998:473-82.

6 Xiong Z，Liu C，Wang F，et al.Protective effects of breviscapine on ischemic vascular dementia in rats〔J〕.Biol Pharm Bull，2006;29(9):1880-5.

7 Blalock EM，Chen KC.Sharrow K，etal.Genemicroarrays in hippocampal aging:statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment〔J〕.JNeurosci，2003;23(9):3807-19.

R965

A

1005-9202(2011)12-2274-02

1 河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學院制藥系 2 石家莊高等醫(yī)學?？茖W校

王 剛(1969-)，男，碩士，副教授，主要從事藥物藥理學研究。

李杰茹(1969-)，女，碩士，高級講師，主要從事老年抗衰老、抗癡呆研究。

〔2010-10-26收稿 2011-01-20修回〕

(編輯 劉 愉/曹夢園)