周井鐸 鄔 巍 郭云寶 魯質(zhì)成 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021)

GDNF修飾脂肪間質(zhì)干細(xì)胞移植治療帕金森病模型大鼠的實驗研究

周井鐸 鄔 巍 郭云寶 魯質(zhì)成 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021)

目的 探討GDNF修飾脂肪間質(zhì)干細(xì)胞移植治療帕金森病大鼠的可行性。方法 移植GNDF修飾的脂肪間質(zhì)干細(xì)胞到模型大鼠紋狀體內(nèi)。術(shù)后定期對大鼠進行旋轉(zhuǎn)行為學(xué)測試，分別于移植后的2、4、6、8 w進行移植區(qū)免疫組化檢測TH表達(dá)，觀察多巴胺能神經(jīng)元存活。結(jié)果ADSCs表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44。ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中有分泌的GDNF，分泌量隨培養(yǎng)時間的延長而增加，在培養(yǎng)的第24、48、72、96小時分泌量分別為(533.424±204.177)、(692.431±162.044)、(1 367.893±102.876)、(1 952.201±109.690)pg/ml，未行基因轉(zhuǎn)染的 ADSCs培養(yǎng)上清液未檢測到GDNF的分泌。GDNF-ADSCs組DN神經(jīng)元存活率較模型組和單純細(xì)胞移植組高，而且在第8周時觀察到該組神經(jīng)元存活率比前一時間點增高約10%。阿撲嗎啡誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)實驗顯示單純ADSCs移植組較模型組旋轉(zhuǎn)次數(shù)下降，而ADSCs-GDNF組的旋轉(zhuǎn)次數(shù)較ADSCs組下降，6 w以后尤其顯著(P＜0.05)。結(jié)論 移植GNDF修飾的脂肪間質(zhì)干細(xì)胞到模型大鼠紋狀體內(nèi)能夠成活，TH表達(dá)陽性的多巴胺能神經(jīng)元存活增加，大鼠帕金森模型行為學(xué)癥狀改善。

膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;脂肪間質(zhì)干細(xì)胞;多巴胺能神經(jīng)元

近年來，腦內(nèi)移植技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合治療帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)，成為一新的研究熱點。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓來源的多能干細(xì)胞，具有來源豐富、取材方便、操作簡易、免疫原性弱、移植方法簡單、能夠轉(zhuǎn)染長期表達(dá)外原基因的特點;并可作為基因治療的載體，承載某些難以通過血-腦屏障的藥物和細(xì)胞因子，將有治療作用的物質(zhì)釋放到中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔1～3〕。研究證實，脂肪間質(zhì)干細(xì)胞(Adiposederived stem cells，ADSCs)同樣具有 BMSCs 的生物學(xué)特性〔4〕。膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialeellline-derived neurotrophie factor，GDNF)可以促進中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元存活〔5〕，并對DA神經(jīng)元的存活、分化及DA的攝取表現(xiàn)出特異性〔6〕。有研究證明，GDNF可以促進黑質(zhì)紋狀體通路再生，還可以促進DA能神經(jīng)元的生長〔7〕。本研究建立PD動物模型，觀察移植經(jīng)GDNF修飾后的ADSCs對PD動物模型的治療作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 動物:Wistar大鼠購自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心。大鼠立體定向儀(日本Narishige公司，SR-6N型)，筆式小型磨鉆(韓國世新精密公司)。細(xì)胞培養(yǎng)試劑:DMEM/F12和小牛血清(FBS)購自Gibco公司;GDNF購自PeproTech公司。酪氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體購自武漢博士德生物公司。內(nèi)毒素(LPS)購自Sigma公司。Alexa Fluor 555標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Invitrogen公司。ELISA試劑盒，Promega公司。CO2氣體恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO，倒置相差顯微鏡，Olympus。Fluview 1000激光掃描共聚集顯微鏡，Olympus。

1.2 方法

1.2.1 PD動物模型制備 參照大鼠立體定位圖譜，將LPS注入右側(cè)黑質(zhì)，2 w后，阿撲嗎啡腹腔注射(5 m l/kg體重)，PD模型旋轉(zhuǎn)檢測儀記錄動物向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)情況，360°為一次，每次記錄30 min。一般認(rèn)為，平均旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7次/min為成功的PD大鼠模型。

1.2.2 ADSCs分離、鑒定 根據(jù)參考文獻〔4〕的方法進行分離。取Wistar大鼠深度麻醉后行腹股溝直切口，無菌條件下切取皮下脂肪。培養(yǎng)基漂洗，清除包膜、結(jié)締組織及小血管。剪碎脂肪組織移入離心管內(nèi)以0.075%膠原酶37℃消化30min。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吸管輕柔吹打數(shù)次，將液性部分移入離心管，1 000 r/min離心 10 min，棄掉上清，以10%FBS的DMEM培養(yǎng)基再次重懸，200目濾網(wǎng)過濾，計數(shù)細(xì)胞存活率為90%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106細(xì)胞/ml，接種于35 mm培養(yǎng)皿中。取第3代ADSCs，離心后棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入抗鼠CD44，行流式細(xì)胞儀鑒定。

1.2.3 ELISA法檢測GDNF 取第3代培養(yǎng)的ADSCs，當(dāng)細(xì)胞生長至60%融合時，以濃度1×109vp/ml的GDNF重組腺病毒作用細(xì)胞1 h后，轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，通過ELISA方法檢測培養(yǎng)上清GDNF水平。

不同的時間點收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于檢測GDNF的含量。檢測方法參照Promega公司的說明書進行抗體包被，將GDNF單克隆抗體用包被緩沖液1∶1 000稀釋后，加入96孔板中，100μl/孔，4℃孵育過夜?？贵w封閉，棄除抗體包被液，每孔加入200μl封閉緩沖液，室溫作用1 h。GDNF標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。加入待測樣品，每孔中加入 100μl待測上清，室溫?fù)u蕩500 r/min，孵育6 h。棄除樣品，用洗滌緩沖液洗滌3次。96孔板中加入抗GDNF的多克隆抗體，每孔100μl，4℃孵育過夜。洗滌緩沖液重復(fù)洗滌3次。96孔板中加入檢測抗體，每孔100μl。室溫孵育2 h。用洗滌緩沖液重復(fù)洗滌3次。每孔中加入100μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)I溶液顯色，室溫孵育15 min，每孔加入100μl鹽酸液(INHCL)終止反應(yīng)，孔中的藍(lán)色液體變成黃色。用酶標(biāo)儀讀取波長450 nm處光吸收值。讀板在終止反應(yīng)后30 min內(nèi)進行。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品GDNF含量。

1.2.4 分組 將動物隨機分為模型組12只，單純細(xì)胞移植組(ADSCs)12只，GDNF修飾細(xì)胞移植組(GDNF-ADSCs)12只，以正常大鼠為對照。將ADSCs組及GDNF-ADSCs組用0.25%胰酶消化細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吸管輕柔吹打數(shù)次，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清，以無血清DMEM培養(yǎng)基再次重懸，200目濾網(wǎng)過濾，計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106細(xì)胞/μl。移植靶點取紋狀體內(nèi)兩點①前囟前(AP)1.8 mm，中線右(MR)2.4 mm，硬腦膜下(DV)4.7 mm;②AP 1.0 mm，MR 3.4 mm，DV 4.5 mm〔8〕。腹腔內(nèi)注射 10%水合氯醛深度麻醉大鼠。固定大鼠到立體定向儀上注射，5μl/只(1μl/min)，注射后停針5 min，緩慢退針(1 mm/min)，縫合切口。術(shù)后實驗動物正常飼養(yǎng)。

1.2.5 功能實驗 分別于術(shù)后2、4、6、8 w進行旋轉(zhuǎn)行為測試，大鼠的腹內(nèi)注射阿撲嗎啡0.5 mg/kg，注射10 min后開始觀察，并記錄大鼠的旋轉(zhuǎn)行為共記錄30 min。

1.2.6 免疫組化 模型組大鼠3只、ADSCs細(xì)胞組大鼠3只及GDNF-ADSCs組大鼠3只分別于移植后的2、4、6、8 w取紋狀體和黑質(zhì)部分腦片進行免疫組織化學(xué)染色顯示TH表達(dá)。大鼠麻醉。頸總動脈灌注生理鹽水40 ml，然后灌注4%多聚甲醛200 m l，斷頭取腦，固定于4%多聚甲醛中，脫水、包埋，常規(guī)石蠟切片，片厚5～6μm。腦組織切片脫蠟至水，3%H2O2，30 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，5%羊血清封閉，37℃，1 h，加入一抗，4℃，過夜，加入生物素化的二抗，37℃，30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)避光顯色，5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用Sigma Stat2.03軟件。所有數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用單因素方差分析，q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs鑒定(流式細(xì)胞儀) 以CD44抗體標(biāo)記ADSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測CD44陽性細(xì)胞為84.28%。

2.2 ADSCs表達(dá)GDNF ELISA試劑盒檢測顯示在培養(yǎng)上清液中有分泌的GDNF，分泌量隨培養(yǎng)時間的延長而增加(在培養(yǎng)的第 24、48、72、96小時)分泌量分別為(533.424±204.177)、(692.431 ± 162.044)、(1 367.893 ± 102.876)、(1 952.201±109.690)pg/m l。未行基因轉(zhuǎn)染的ADSCs培養(yǎng)上清液未檢測到GDNF的分泌。

2.3 GDNF修飾的ADSCs移植DA神經(jīng)元存活的影響 DA神經(jīng)元表達(dá)特異性細(xì)胞標(biāo)志蛋白TH，采用免疫組化方法標(biāo)記紋狀體區(qū)域的DA神經(jīng)元。術(shù)后2 w時，模型組大鼠DA神經(jīng)元存活率較對照組明顯減少，僅為對照組的30%;ADSCs組大鼠DA神經(jīng)元存活率有所升高達(dá)到42%;GDNF-ADSCs組大鼠DA神經(jīng)元存活率最高達(dá)50%。觀察不同時間點各組大鼠DA神經(jīng)元存活情況發(fā)現(xiàn)GDNF-ADSCs組DA神經(jīng)元存活率最高，而且在第8周時觀察到該組神經(jīng)元存活率比前一時間點增高約10%。見圖1。

圖1 不同模型組對DN神經(jīng)元存活率的影響

2.4 功能實驗結(jié)果 阿撲嗎啡誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)實驗顯示單純ADSCs組較模型組旋轉(zhuǎn)次數(shù)下降，而ADSCs-GDNF組的旋轉(zhuǎn)次數(shù)較ADSCs組下降，6 w以后尤其顯著，各時間點有明顯差異(P＜0.05)。見表1。

表1 PD大鼠移植后旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測結(jié)果(±s，轉(zhuǎn)數(shù)/m in)

表1 PD大鼠移植后旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測結(jié)果(±s，轉(zhuǎn)數(shù)/m in)

與ADSCs-GDNF組比較:1)P＜0.05

組別 移植前 移植后2 w 移植后4 w 移植后6 w 移植后8 w模型組 20.2±2.6 19.5±1.8 20.1±2.1 20.5±1.91)21.6±2.01)ADSCs組 20.2±2.6 18.3±1.5 17.2±1.3 13.2±1.41)10.2±1.71)ADSCs-GDNF組20.2±2.6 16.5±1.2 13.4±1.8 10.5±1.5 6.8±1.2

3 討論

細(xì)胞移植是近年興起的一種治療PD的新興技術(shù)，主要是針對DA神經(jīng)元死亡進行的細(xì)胞替代治療。胚胎干細(xì)胞首先被用于腦內(nèi)移植，但由于倫理等原因，其使用受到限制。近來研究的熱點集中到成體干細(xì)胞，尤其是對BMSCs的研究，但是從骨髓中獲取BMSC會給病人帶來一定痛苦，且骨髓總量有限，BMSCs在整個骨髓單核細(xì)胞總數(shù)中所占的比例低，且隨著年齡增長逐漸下降，可獲取的干細(xì)胞數(shù)量少。

ADSCs具有來源豐富、采集方便、體外擴增快和自體移植等特點，同骨髓基質(zhì)組織同起源于中胚層的脂肪，因其內(nèi)存在的干細(xì)胞與骨髓來源的干細(xì)胞具有很多相似性且可向神經(jīng)細(xì)胞分化而更有利于神經(jīng)移植研究〔4〕。在本實驗發(fā)現(xiàn)ADSCs的表面標(biāo)志表達(dá)為CD44與BMSCs具有相同的表達(dá)。在以往的實驗研究中也驗證了ADSCs具有向神經(jīng)細(xì)胞、成骨等多方向分化的特性。這與文獻報道是一致的。

GDNF是在PD治療研究中最受關(guān)注的神經(jīng)營養(yǎng)因子，也是在動物實驗中對PD治療有比較肯定療效的神經(jīng)營養(yǎng)劑和保護劑〔9〕。有研究證明GDNF能保護并促進紋狀體和軸突中前突觸DA能神經(jīng)元的生存〔10〕。雖然GDNF是DA神經(jīng)元發(fā)育和維持生長過程中的重要因子，對中腦DA神經(jīng)元有保護和修復(fù)作用〔11〕。但由于其受體分布廣泛，且不易通過血腦屏障等缺點，常規(guī)給藥無法起作用，使其在臨床的應(yīng)用受到明顯的限制。而干細(xì)胞所具有的生物學(xué)特性及優(yōu)點，使其廣泛應(yīng)用于臨床成為可能。有研究證明，胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞均能夠誘導(dǎo)成DA能神經(jīng)元〔12〕;也有大量報道，BMSCsw跨系分化成DA能神經(jīng)元〔13〕。但也有研究報道干細(xì)胞誘導(dǎo)成DA能神經(jīng)元的效率低，誘導(dǎo)后可供移植的細(xì)胞存活率低，以及在體內(nèi)移植細(xì)胞存活時間短〔14〕。因此移植經(jīng)修飾的干細(xì)胞，利用其良好的擴增能力，穩(wěn)定表達(dá)目的基因產(chǎn)物，可以作為轉(zhuǎn)基因載體結(jié)合有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可能對PD的治療更加有益。

本實驗取第三代培養(yǎng)的ADSCs，GDNF重組腺病毒轉(zhuǎn)染ADSCs，并通過ELISA方法檢測培養(yǎng)上清GDNF水平。發(fā)現(xiàn)GDNF的表達(dá)隨培養(yǎng)時間的延長而增加。這與文獻報道GDNF轉(zhuǎn)染BMSCs的表達(dá)一致。這也再一次驗證ADSCs與BMSCs具有相似的生物學(xué)物性。通過對模型組和ADSCs組的觀察發(fā)現(xiàn)，ADSCs定居受損部位后受損部位的DA神經(jīng)元存活率較模型組高，推測可能是由于其分泌一些細(xì)胞因子，對受損部位起到一定的保護作用。觀察到GDNF-ADSCs組DA神經(jīng)元的存活率最高，且隨時間的延長DA神經(jīng)元的存活數(shù)目增加，在第8周時較上1 w存活數(shù)目增加10%。這有可能是ADSCs轉(zhuǎn)染GDNF后能夠穩(wěn)定的表達(dá)，且隨時間的延長而增加使得DA神經(jīng)元得到GDNF的營養(yǎng)、支持和保護作用，同時也可能使一些具有分化潛能的前體細(xì)胞在GDNF和ADSCs分泌的細(xì)胞因子的共同作用下誘導(dǎo)DA能表型出現(xiàn)，分化成新的DA神經(jīng)元。通過動物模型觀察到ADSCs-GDNF組阿撲嗎啡誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)實驗的旋轉(zhuǎn)次數(shù)最少，這可能是跟ADSCs穩(wěn)定表達(dá)GDNF，對DA神經(jīng)元起到保護作用有關(guān)。

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R246

A

1005-9202(2011)12-2269-03

吉林省科技發(fā)展基金資助項目(No.200505214)

魯質(zhì)成(1955-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事腦出血與脊髓方面研究。

周井鐸(1982-)，男，在讀碩士，主要從事腦出血與脊髓方面研究。

〔2010-02-09收稿 2010-11-19修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)