于立博 龔建福 劉繼文 (新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

維藥鷹嘴豆中金屬硫蛋白提取液對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

于立博 龔建福 劉繼文 (新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

目的 研究鷹嘴豆金屬硫蛋白(MT)體外抑制腫瘤的效果。方法 將人肺癌細(xì)胞株(A549)、人胃癌細(xì)胞株(MGC-803)、人乳腺癌細(xì)胞株(Bcap-37)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將提取的鷹嘴豆MT配制成5個(gè)濃度組:0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 g/ml，空白對(duì)照組和本底對(duì)照組。觀察腫瘤細(xì)胞的抑制率和凋亡率。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，0.010 0、0.005 0、0.001 0 g/ml三個(gè)濃度組的腫瘤抑制率和細(xì)胞凋亡率均增加。結(jié)論?dān)椬於筂T可抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞;體外培養(yǎng);鷹嘴豆金屬硫蛋白

金屬硫蛋白(MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。1957年Margoshes和Valles在研究鎘的生物學(xué)作用時(shí)，分離出該物質(zhì)。MT具有廣泛的生理功能，MT的應(yīng)用研究已成為一個(gè)新熱點(diǎn)，其中MT與腫瘤的關(guān)系，其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及其在腫瘤治療中的應(yīng)用已經(jīng)成為該領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有動(dòng)植物組織(哺乳動(dòng)物結(jié)締組織除外)、原核、真核微生物中均能分離出MT。本實(shí)驗(yàn)主要觀察維藥鷹嘴豆中植物MT提取液體外抑制腫瘤的作用，為今后的藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 滅菌胎牛血清(FBS，500 ml，Gibco，批號(hào):05030313L6)，DMEM 粉(Gibco，批號(hào):12100-046)，胰蛋白酶(美國，DIFCO Laboratories)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國Bio-RAD公司，∑960)。流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson，型號(hào):FACSVantageSE)。

1.2 鷹嘴豆MT制備 新疆木壘縣當(dāng)年產(chǎn)鷹嘴豆，由新疆農(nóng)科院種子供應(yīng)站提供。將鷹嘴豆種子風(fēng)干磨碎過80目篩，加入0.1 mol/L，pH8.6的Tris-HCl緩沖液后采用超聲充分破碎，后于4℃冰箱過夜抽提。于4℃抽提，10 000 r/min離心30 min，收集上清液。上清液于100℃水浴加熱2～3 min，后于4℃下10 000 r/min離心20 min。收集上清液，加入3倍體積的－20℃的預(yù)冷無水乙醇，過夜沉淀后，于4℃下12 000 r/min離心20 min。取沉淀加入5ml0.01mol/L Tris-HCl緩沖液溶解數(shù)小時(shí)，然后在4℃下15 000 r/min離心20 min，收集上清液即MT提取液，將以上提取液于－20℃下冷凍30 h后，放入冷凍干燥機(jī)制成凍干粉備用。

1.3 受試細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株(A549)、人胃癌細(xì)胞株(MGC-803)、人乳腺癌細(xì)胞株(Bcap-37)均由中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫提供。將A549、MGC-803、Bcap-37常規(guī)培養(yǎng)于25 cm培養(yǎng)瓶中，每2～3 d換1次液，每2～3 d傳代1次。

1.4 鷹嘴豆MT體外抑瘤實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組分為0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 g/ml 5 個(gè)濃度組(用 5%DMEM培養(yǎng)液溶解MT凍干粉配制)、空白對(duì)照組(含同一細(xì)胞密度的培養(yǎng)液)和本底對(duì)照組(等體積含相應(yīng)濃度的MT凍干粉的無細(xì)胞培養(yǎng)液)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=〔(空白對(duì)照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值)/空白對(duì)照組A均值〕×100%。同時(shí)取以上對(duì)數(shù)期細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶消化傳代后待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%滿度時(shí)，用移液槍小心吸棄舊培養(yǎng)液，加入含有不同濃度受試物(濃度為0.01，0.005 g/ml)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果 對(duì)于Bcap-37細(xì)胞株，當(dāng)MT濃度分別為:0.000 1、0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時(shí)，各濃度組的A值均明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05);對(duì)于A549細(xì)胞株，當(dāng)受試物濃度分別為:0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時(shí)，各濃度組的A值均顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.05)，而0.000 1與0.000 5 g/ml濃度組的A值與空白對(duì)照組比較無顯著差異(P＞0.05);對(duì) MGC-803細(xì)胞株，受試物濃度為:0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時(shí)，各濃度組A值明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05)，而濃度為0.000 1 g/m l組的A值與空白對(duì)照組比較無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 細(xì)胞凋亡情況的測(cè)定 用AV(AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶(PI)雙染 A549、MGC-803、Bcap-37，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況，見表2和圖1。用0.010 0和0.005 0 g/ml鷹嘴豆MT干預(yù)24 h后，三種癌細(xì)胞的凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01)，其中干預(yù)效果最好的是MGC-803，凋亡率達(dá)到了28.60%，說明胃癌MGC-803細(xì)胞對(duì)受試物更敏感。

表1 鷹嘴豆MT對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(±s)

表1 鷹嘴豆MT對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較:1)P＜0.05，下表同

組別(g/ml) A值抑制率(%)Bcap-37 A549 MGC-803空白對(duì)照組Bcap-37 A549 MGC-803 0.445±0.038 0.376±0.019 23.34 3.68 5.05 0.407±0.018 0.462±0.025 0.396±0.041 － － －0.010 0 0.154±0.0251) 0.148±0.0101) 0.196±0.0231) 62.16 67.97 50.50 0.005 0 0.201±0.0111) 0.265±0.0181) 0.211±0.0251) 50.61 42.64 46.72 0.001 0 0.253±0.0281) 0.352±0.0631) 0.256±0.0251) 38.57 23.80 35.36 0.000 5 0.300±0.0581) 0.420±0.047 0.350±0.0161) 24.29 9.13 11.62 0.000 1 0.312±0.0211)

表2 鷹嘴豆MT對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響(±s，%)

表2 鷹嘴豆MT對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響(±s，%)

組別(g/ml)Bcap-37 A549 MGC-803空白對(duì)照組5.70±0.31 0.10±0.01 4.40±0.11 0.005 0 15.00±1.311) 20.50±1.21 14.06±1.241)0.010 0 22.70±1.231) 21.70±1.151) 28.60±1.451)

圖1 不同濃度鷹嘴豆MT對(duì)Bcap-37、A549和MGC-803細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析

3 討論

MT是人體內(nèi)重要的自由基清除劑，其清除自由基的能力是谷胱甘肽的800倍。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性基因突變是導(dǎo)致內(nèi)源性損傷最重要的原因，而基因突變是腫瘤發(fā)生的重要原因。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，既與細(xì)胞增殖過度有關(guān)，又與細(xì)胞凋亡不足有關(guān)〔2〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鷹嘴豆MT具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞作用，且具有明顯的劑量依賴性。除了極低濃度組對(duì)A549、MGC-803兩種癌細(xì)胞未見抑制作用外，其他濃度組均有抑制作用，其中對(duì)Bcap-37和MGC-803的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)A549細(xì)胞最高濃度(0.010 0 g/ml)具有較強(qiáng)的抑制效果，抑制率達(dá)到了67.97%。說明鷹嘴豆 MT對(duì) Bcap-37和MGC-803細(xì)胞的抑制作用更敏感。通過流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆MT對(duì)3種瘤細(xì)胞的凋亡均有促進(jìn)作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

傳統(tǒng)的放療、化療和生物治療手段對(duì)腫瘤早期治療效果顯著，但是腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移便會(huì)給治療帶來極大困難?；?、放療對(duì)腫瘤患者的體液免疫和細(xì)胞免疫功能都有不同程度的損害，腫瘤患者化、放療后的NK細(xì)胞活性、免疫球蛋白水平以及T細(xì)胞總數(shù)都有明顯下降，其中 CD8的值明顯升高〔3〕。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤物質(zhì)仍是當(dāng)前的主要研究方向。

本實(shí)驗(yàn)選用目前最常見3種癌細(xì)胞菌株作為受試物，觀察鷹嘴豆MT的體外抑制腫瘤效果，雖然具有一定的代表性，但不是很全面，不能代表所有的腫瘤類型，所以在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該對(duì)各種類型的癌細(xì)胞進(jìn)行全面的實(shí)驗(yàn)，以期全面了解外源性植物MT對(duì)腫瘤的治療效果，為今后MT的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 包怡紅，李銳達(dá)，梁 雪，等.乳清蛋白肽對(duì)衰老小鼠抗氧化能力的影響〔J〕.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010;32(3):239-41.

2 彭新顏，孔保華，熊幼翎.乳清多肽對(duì)D-半乳糖衰老模型大鼠血清和臟器組織抗氧化效果的影響〔J〕.食品科學(xué)，2010;31(9):238-42.

3 彭新顏，孔保華，熊幼翎.乳清蛋白抗氧化肽對(duì)H2O2所致人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5過氧化損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010;43(14):2982-9.

R73

A

1005-9202(2011)12-2242-02

新疆維吾爾自治區(qū)教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.XJEDU2005I16)

于立博(1974-)，女，碩士，講師，主要從事營養(yǎng)與疾病研究。

〔2011-01-13收稿 2011-04-08修回〕

(編輯 張 慧)