魯帥堯，和占龍，陳麗雄，趙 遠(yuǎn)，禹文海，王俊斌，楊鳳梅

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118）

獼猴（Macaca malutta）是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，人 工飼養(yǎng)繁殖已有50多年歷史。人工飼養(yǎng)繁殖的實(shí)驗(yàn)獼猴遺傳背景清楚、生理生化指標(biāo)穩(wěn)定，在生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用，同時(shí)也是研究人類健康和疾病的理想動(dòng)物模型。隨著生物醫(yī)學(xué)研究的不斷發(fā)展和靈長(zhǎng)類動(dòng)物在該領(lǐng)域研究中應(yīng)用的特殊意義，獼猴資源日趨顯得極為珍貴。由于野生資源有限，人工飼養(yǎng)繁殖是各研究領(lǐng)域獲得實(shí)驗(yàn)獼猴的重要手段，但是獼猴在人工繁殖中由于對(duì)其營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究不夠深入，還存在很多與營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的問(wèn)題有待解決［1］。在冬春季節(jié)脫毛現(xiàn)象較為普遍，不僅影響了的外觀，也使獼猴自身的健康造成損害，嚴(yán)重影響了動(dòng)物質(zhì)量。根據(jù)文獻(xiàn)資料表明，獼猴脫毛因素有多種，甚至是多種因素共同作用結(jié)果，如皮膚真菌、寄生蟲、健康狀況、營(yíng)養(yǎng)、動(dòng)物本身的激素水平等。依據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及本單位猴群的具體脫毛情況，我們?cè)谂懦思纳x等因素后，對(duì)獼猴脫毛展開了相關(guān)營(yíng)養(yǎng)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定與分析。［2-4］

礦物元素是動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝等生命過(guò)程不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中的微量元素雖在體內(nèi)含量甚微，卻具有調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)，促進(jìn)常量元素在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，參與合成及構(gòu)成某些營(yíng)養(yǎng)素等多種生物學(xué)功能［5］。被毛是動(dòng)物排泄金屬離子的器官之一，被毛中微量元素的含量能較敏感、穩(wěn)定地反映體內(nèi)元素水平，測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)的微量元素含量對(duì)了解動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)狀況具有重要的指導(dǎo)意義［6］。被毛中的氨基酸主要以角蛋白的形式存在，屬于不溶性蛋白質(zhì)，具有特殊的結(jié)構(gòu)，呈纖維狀、穩(wěn)定性高、彈性好、膨脹性小，經(jīng)水解可以得到18種天然氨基酸［7］。根據(jù) W.G.Crewthr的研究，高硫蛋白質(zhì)富寓于羊毛纖維的胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和色氨酸中，這些氨基酸主要構(gòu)成纖維中的基質(zhì)，沒(méi)有α-螺旋結(jié)構(gòu)；低硫蛋白質(zhì)富寓于谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸中，并主要構(gòu)成纖維中基原纖，有50％左右的α-螺旋結(jié)構(gòu)，有利于毛纖維的高結(jié)晶度和增大強(qiáng)力［8］。因此，根據(jù)獼猴人工養(yǎng)殖普遍存在的被毛質(zhì)量問(wèn)題［2］，結(jié)合野外猴被毛質(zhì)量較好的特點(diǎn)，本研究對(duì)具有不同被毛品質(zhì)的獼猴的被毛進(jìn)行了6種微量元素和18種氨基酸含量的測(cè)定，同時(shí)測(cè)定其血清中的8種礦物元素，評(píng)定脫毛獼猴與具有不同被毛品質(zhì)獼猴的礦物元素和氨基酸的營(yíng)養(yǎng)狀況，以便于從調(diào)整飼料營(yíng)養(yǎng)素水平方式，來(lái)改善和提高人工養(yǎng)殖獼猴被毛質(zhì)量及其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所［SCXK （滇）2010-0006）］和普洱市提供，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 儀器設(shè)備

原子吸收分光光度計(jì)（德國(guó)V6），原子熒光光度計(jì)（AFS-930），日立L8800氨基酸自動(dòng)分析儀（日本日立公司），高速離心機(jī)，全自動(dòng)生化分析儀（Olympus Au5400）。

1.3 方法

1.3.1 分組：選擇具有不同被毛品質(zhì)的成年獼猴共30只，雌雄隨機(jī)搭配。分為 A、B、C三組，每組10只，其中A組是從飼養(yǎng)場(chǎng)隨機(jī)挑選的脫毛猴，按本場(chǎng)的獼猴飲食制度和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，被毛脫落、稀疏且光澤度差；B組是從半自然圈養(yǎng)環(huán)境（猴園）中隨機(jī)挑選的，自由采食本場(chǎng)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的飼料，被毛覆蓋良好但光澤度差；C組是來(lái)自云南省普洱市鎮(zhèn)源縣的野生猴，自由采食野外食物，被毛覆蓋很好且光澤度很好。

1.3.2 取樣

1.3.2.1 用毛剪取試驗(yàn)猴頭部、背部、腹部、四肢和尾部被毛，每只采集樣品量為30 g；充分混勻后用洗潔精清洗，再用清水漂洗干凈，自然風(fēng)干，裝樣品袋封存待用。

1.3.2.2 后肢靜脈采血3 m L，制備血清，-20℃冰箱保存，備用。

1.3.3 被毛樣品處理

1.3.3.1 微量元素測(cè)定：稱取3 g猴毛樣品，置于瓷坩堝中緩慢加熱至炭化，在 500℃高溫下加熱5 h。直至樣呈灰白色。冷卻，用少量水潤(rùn)濕，然后加5 m L硝酸（1+1），3 m L鹽酸（1+1），在120℃電熱板上加熱，待消解液剩1/3時(shí)，把溶液轉(zhuǎn)入50 m L容量瓶中，同時(shí)加入 5 m L（50 g/L）硫尿、5 mL （50 g/L）抗壞血酸，然后用蒸溜水定容至刻度，靜止30 min后，用中速濾紙過(guò)濾。濾液分別用原子吸收分光光度計(jì)和原子熒光光度計(jì)測(cè)定其微量元素含量。

1.3.3.2 氨基酸測(cè)定：采用毛發(fā)水解法水解被毛角蛋白。先稱取含蛋白7.5～25 mg的試樣（約50～100 mg，準(zhǔn)確至 0.1 mg）于 20 m L安瓿中，加10.00 mL酸解劑（6 mol/L鹽酸溶液），置液氮或干冰（丙酮）中冷卻，然后抽真空至7 Pa（≤5×10-2mmHg）后封口。將水解管放在110℃恒溫干燥箱中，水解22～24 h，之后冷卻、混勻、開管、過(guò)濾，用移液管吸取適量的濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或濃縮器中，保持60℃抽真空蒸發(fā)至干，必要時(shí)加少許水重復(fù)蒸干1～2次；加入3～5 mL pH值2.2的檸檬酸鈉緩沖液，使樣品液中氨基酸濃度達(dá)50～250 nmol/m L，搖勻、過(guò)濾或離心取上清液，即可上機(jī)測(cè)定。

1.3.4 分析項(xiàng)目及檢測(cè)方法：

1.3.4.1 用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定被毛中銅（Cu）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鋅（Zn）；用原子熒光光度計(jì)測(cè)定鉛（Pb）、砷（As）。

1.3.4.2 被毛氨基酸測(cè)定項(xiàng)目有，天門冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Gystine）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、氨（NH3）。氨基酸分析儀的主要色譜條件和技術(shù)指標(biāo)，進(jìn)樣量為20μL，分離柱（離子交換柱）溫度為50℃，反應(yīng)柱溫度為130℃；定量測(cè)定重現(xiàn)性變異系數(shù)CV值≤1％。

1.3.4.3 血清中K、Na、Cl采用間接離子選擇電極法，Ca采用OCPC法，P采用直接紫外法，Mg采用絡(luò)合指示劑法，F(xiàn)e采用亞鐵嗪法，Cu采用原子吸收光譜法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［9］。

2 結(jié)果

2.1 被毛微量元素的測(cè)定和分析結(jié)果

三組試驗(yàn)獼猴被毛中6種微量元素的測(cè)定及分析結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，A組、B組和C組試驗(yàn)猴被毛的Cu、Fe含量分別為12.45 mg/kg、11.90 mg/ kg、12.70 mg/kg和 40.80 mg/kg、55.20 mg/kg、48.70 mg/kg，Mn的含量分別為3.29 mg/kg、3.41 mg/kg、0.63 mg/kg，Zn的含量分別為 136.00 mg/ kg、123.00 mg/kg、149.00 mg/kg，Pb的含量分別為2.34 mg/kg、4.98 mg/kg、1.32 mg/kg，As的含量分別為0.02 mg/kg、0.03 mg/kg、0.01 mg/kg。各組試驗(yàn)猴被毛Cu、Fe含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但Mn、Zn、Pb、As則均有極顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 被毛氨基酸含量測(cè)定和分析結(jié)果

三組試驗(yàn)獼猴被毛的氨基酸含量測(cè)定分析的結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果為被毛脯氨酸、纈氨酸、氨和精氨酸的含量A組和B組極顯著低于C組（P＜0.01），而A組與B組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；C組被毛胱氨酸含量高于A組2.06％（P＜0.01）和高于B組4.44％（P＜0.01）。被毛酪氨酸含量則是 A顯著低于B組（P＜0.05），且極顯著低于 C組（P＜0.01），B組又顯著低于 C組（P＜0.05）；被毛苯丙氨酸含量是B組高于C組（P＜0.05），且高于A組（P＜0.01），C組又高于A組（P＜0.05）；被毛賴氨酸、組氨酸和氨基酸總量含量是C組高于A組（P＜0.05）和高于 B組（P＜0.01），A組高于B組（P＜0.05）。其余氨基酸均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 血清礦物元素測(cè)定和分析結(jié)果

血清礦物元素的檢測(cè)及分析結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，A、B組的Mg、P、Cu和Ca的含量高于C組，其余礦物元素的含量基本一致。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，A組和B組Mg、P和Cu的含量與C組差異顯著（P＜0.01），而A組與B組差異不顯著（P＞0.05）； A組中Ca的含量與C組差異顯著（P＜0.01），但B組與A組和C組均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；血清K、Na、Cl、Fe的含量在各組間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 不同被毛品質(zhì)獼猴被毛微量元素含量（mg/kg）Tab.1 The contents of trace elements in different quality hair of Macaca mulatta（mg/kg）

表3 不同被毛品質(zhì)獼猴血清中礦物元素含量的測(cè)定結(jié)果Tab.3 The content of trace elements in Serum of Macaca mulatta of different quality hair

3 討論

3.1 微量元素與被毛質(zhì)量的分析

不同品質(zhì)的獼猴被毛微量元素 Cu和 Fe含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但是被毛Cu的含量是C組高于A組和B組，F(xiàn)e的含量則是B組高于C組和A組。Cu是動(dòng)物體內(nèi)賴氨酸氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、單胺氧化酶等30多種酶的活性成分，參與細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)和造血過(guò)程；Fe參與血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化物酶、觸酶合成等［10］。因此，結(jié)合分析結(jié)果可以看出，Cu和 Fe應(yīng)該不是影響人工飼養(yǎng)猴被毛質(zhì)量的主要微量元素。被毛Mn含量的測(cè)定結(jié)果是A組和B組高于C組（P＜0.01），但 A組和 B組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Mn是丙酮酸氧化酶、超氧化物歧化酶、精氨酸酶等的組成成分，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和內(nèi)分泌有影響［11］，過(guò)量易蓄積于睪丸組織并造成一系列毒性作用［12-14］。從不同被毛品質(zhì)分組的試驗(yàn)猴被毛Mn的含量分析，被毛質(zhì)量?jī)?yōu)的野外猴被毛Mn的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人工飼養(yǎng)猴（P＜0.01），這與高云芳等［15］在川金絲猴上的研究結(jié)果是一致的。因此，環(huán)境或飼料中Mn超標(biāo)應(yīng)該是造成人工飼養(yǎng)獼猴被毛Mn含量較高的原因，實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)也表明飼料中不添加Mn制劑對(duì)人工飼養(yǎng)獼猴的被毛有一定的改善作用，所以Mn過(guò)量很可能是影響獼猴被毛質(zhì)量的因素之一。被毛Zn的含量分析結(jié)果是C組高于A組、A組高于 B組，并有極顯著性差異（P＜0.01）。Zn是微量元素中研究得比較充分的微量元素，臨床上Zn缺乏主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、食欲減退、傷口愈合緩慢、性功能障礙、夜盲癥、脫發(fā)等［16］。結(jié)果顯示，人工飼養(yǎng)猴被毛 Zn的含量低于野外猴，因此Zn的供給不足也應(yīng)該是影響人工飼養(yǎng)獼猴被毛質(zhì)量的因素。被毛重金屬Pb和As的含量是B組高于A組、A組高于C組（P＜0.01）。從Pb在被毛中的沉積可以看出，人工飼養(yǎng)猴的環(huán)境或飼料中Pb的含量高于野外猴，雖然在飼養(yǎng)中未有Pb中毒現(xiàn)象，但與野外猴相比它們?cè)诤锩写罅砍练e。因此，控制飼料中 Pb的含量應(yīng)該是提高獼猴被毛質(zhì)量的一個(gè)有效手段。被毛As的含量雖然人工飼養(yǎng)猴高于野外猴（P＜0.01），但As參與蛋白質(zhì)的代謝；影響血清堿性磷酸酶、γ一谷氨酸轉(zhuǎn)移肽酶的活性；刺激造血器官，小劑量時(shí)能使骨骼造血機(jī)能活躍，促使紅細(xì)胞和血色素新生，改善皮膚營(yíng)養(yǎng)和毛色，興奮神經(jīng)系統(tǒng)，大劑量時(shí)則抑制造血器官；可防止硒中毒，還是碘、汞、鉛的頡頏劑［17］。就 As特殊的營(yíng)養(yǎng)作用，在人工飼養(yǎng)獼猴中的應(yīng)用還有待作進(jìn)一步研究。

3.2 氨基酸與被毛質(zhì)量的分析

由于采用酸水解被毛角蛋白方法進(jìn)行處理，色氨酸被破壞不能進(jìn)行測(cè)定，色氨酸的含量將以氨的形式大概得以體現(xiàn)，因?yàn)樗膺^(guò)程中對(duì)氨基酸的破壞主要以色氨酸為主。被毛 NH3的含量為 A組2.08％、B組2.1％、C組1.36％，這表明本次試驗(yàn)的野外猴組被毛氨基酸的抗水解能力最強(qiáng)，說(shuō)明野外猴的被毛在保持優(yōu)良光澤的性能方面優(yōu)于人工飼養(yǎng)猴［18］，這符合野外猴被毛光澤度優(yōu)于人工飼養(yǎng)猴的實(shí)際情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同品質(zhì)獼猴被毛氨基酸含量有一半以上存在差異。其中被毛脯氨酸、纈氨酸、氨和精氨酸的含量是人工飼養(yǎng)猴（包括A組和B組）低于野外猴組（C組）（P＜0.01），提示在人工飼養(yǎng)猴的食物組成中脯氨酸、纈氨酸、氨（色氨酸）和精氨酸可能不足；被毛胱氨酸的含量也是A組、B組極顯著低于C組（P＜0.01），但B組又極顯著低于A組（P＜0.01）；被毛賴氨酸、組氨酸和氨基酸總量含量是C組顯著高于A組（P＜0.05）和極顯著高于B組（P＜0.01）。根據(jù)此結(jié)果推測(cè)，影響獼猴被毛相應(yīng)氨酸含量的因素不僅是食物相應(yīng)氨酸的含量，生活環(huán)境也有很大的影響；其余的氨基酸含量基本一致。分析結(jié)果表明，C組被毛胱氨酸含量高于A組2.06％（P＜0.01）和高于B組4.44％ （P＜0.01）。胱氨酸對(duì)毛纖維的彈性和強(qiáng)力有一定影響，通常其含量越高毛纖維的彈性和強(qiáng)力也越大［8］。因此，這個(gè)結(jié)果既證明了以上胱氨酸對(duì)被毛的影響作用的理論，也符合野外猴被毛的彈性和強(qiáng)力等質(zhì)量?jī)?yōu)于人工飼養(yǎng)猴的實(shí)際。因此，可以推測(cè)胱氨酸對(duì)改善獼猴被毛品質(zhì)、提高被毛質(zhì)量應(yīng)該有一定作用。對(duì)獼猴被毛進(jìn)行含硫氨基酸的分析。高硫氨基酸包括胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和色氨酸；低硫氨基酸包括谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸。結(jié)果表明，獼猴被毛的高硫和低硫氨基酸總含量分別為 A組29.14％和35.9％、B組26.22％和36.7％、C組30.92％和36.65％，從而也可以推測(cè)C組野外猴被毛的纖維結(jié)晶度較高、強(qiáng)力大、初始模量較大［8］，說(shuō)明野外猴被毛的光澤、品質(zhì)以及抗脫毛能力等均優(yōu)于人工飼養(yǎng)猴。

3.3 血清礦物元素與被毛質(zhì)量的分析

各組試驗(yàn)獼猴血清中礦物元素K、Na、Cl和Fe的含量均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明這些礦物元素的供給和利用在三個(gè)試驗(yàn)組中是相對(duì)一致的。但 Fe含量的測(cè)定分析結(jié)果與黃妙輝等［19］的結(jié)果有所差異。C組血清礦物元素中Mg和P含量極顯著低于A組和B組（P＜0.01）；Ca含量也顯著低于 A組（P＜0.05），而與B組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。微量元素Cu則A組和B組極顯著高于C組（P＜0.01）。引起其顯著差異原因除了食物中礦物元素的含量有差異外，動(dòng)物處于不同生存環(huán)境下對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的需求和利用也是影響其差異的重要原因。根據(jù)測(cè)定結(jié)果推測(cè)，高營(yíng)養(yǎng)水平的Ca、Mg、P和Cu可能會(huì)影響人工飼養(yǎng)的獼猴的被毛質(zhì)量。

本次對(duì)人工飼養(yǎng)獼猴脫毛的營(yíng)養(yǎng)學(xué)部分相關(guān)因素分析研究，可為實(shí)驗(yàn)獼猴的人工飼養(yǎng)繁殖提供一定的營(yíng)養(yǎng)學(xué)參考數(shù)據(jù)［20］，對(duì)脫毛的防治和改善被毛質(zhì)量可提供一定的指導(dǎo)作用。

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