欒萌 唐劍△陳星 周鵬 張燕 劉金同 劉文敏 陳剛

兒童青少年精神分裂癥與GRM 5基因的全基因組關(guān)聯(lián)分析和家系對照研究

欒萌*唐劍△陳星*周鵬*張燕※劉金同※劉文敏*陳剛*

目的 對既往有陽性發(fā)現(xiàn)的促代謝型谷氨酸受體5基因(glutamate receptor，metabotropic 5，GRM5)與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)進(jìn)行驗(yàn)證。方法 先用affymetrix 6.0芯片對89例兒童青少年精神分裂癥與1000例正常對照的DNA分別進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，而后在另一個(gè)樣本－100個(gè)兒童青少年精神分裂癥核心家系中采用高分辨率溶解曲線(High Resolution Melting，HRM)進(jìn)行了 GRM5基因 6個(gè) SNP位點(diǎn) (rs591849，rs16915130，rs3899716，rs2133395，rs597462，rs1942486)的檢測。用HaploView4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 89例兒童青少年精神分裂癥與1000例正常對照的全基因關(guān)聯(lián)分析顯示，GRM5基因的rs16915130位點(diǎn)與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)(χ2=39.895，P=2.68×10－10)，然而通過6個(gè)SNP位點(diǎn)及所構(gòu)建的單倍型在兒童青少年精神分裂癥家系的驗(yàn)證卻不支持GRM5基因與精神分裂癥關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。結(jié)論 本研究不支持GRM5基因與兒童青少年精神分裂癥關(guān)聯(lián)。

精神分裂癥 兒童青少年 親代謝性谷氨酸 單核苷酸多態(tài)性

多年的遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了精神分裂癥的大量的連鎖位點(diǎn)與關(guān)聯(lián)基因［1－3］，但結(jié)果往往難以重復(fù)驗(yàn)證。其中，一般人群的關(guān)聯(lián)對照研究中由于病例對照之間的遺傳結(jié)構(gòu)(人群層化)差異可能帶來假陽性結(jié)果，而以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)對照分析可控制人群層化的混雜因素。因此，研究中可采用兩種方法進(jìn)行相互驗(yàn)證。近年來精神分裂癥谷氨酸假說備受關(guān)注［4－5］，谷氨酸能基因成為了精神分裂癥的主要候選基因之一。既往已有研究表明，促代謝型谷氨酸受體5(glutamate receptormetabotropic 5，GRM5)基因可能與精神分裂癥關(guān)聯(lián)［6－8］。故本研究采用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genomewide association study，GWAS)和核心家系研究的兩步法，在中國人群中對GRM5基因與精神分裂癥的關(guān)系進(jìn)行了探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象 樣本1為來自山東省精神衛(wèi)生中心2005年至2008年期間的兒童青少年精神分裂癥住院患者。入組標(biāo)準(zhǔn):①符合國際疾病分類第10版(ICD-10)精神與行為障礙分類中精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡≤18歲。排除標(biāo)準(zhǔn):①精神發(fā)育遲滯;②孤獨(dú)癥;③情感性精神病;④腦器質(zhì)性疾病、酒精和藥物依賴。共89例，男性45例，女性44例，年齡7～22歲，平均(16.14±2.77)歲，發(fā)病年齡7～17歲，平均(15.15±2.80)歲。對照組為來自山東省血液中心健康獻(xiàn)血者1000名，男性569名，女性431名，年齡17～55歲，平均(23.06±6)歲。樣本1的患者組和對照組用于本研究中的全基因組芯片檢測。

樣本2為來自山東省精神衛(wèi)生中心2005年至2010年期間的兒童青少年期發(fā)病的精神分裂癥患者及其健康父母組成的核心家系100個(gè)?；颊叩娜虢M標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)均同樣本1。其中，患兒與父母組成的家系86個(gè)，患兒與父親或母親組成的單親家系14個(gè);男性患者47例，女性患者53例，年齡7～27歲，平均(16.61±3.06)歲，發(fā)病年齡7～17歲，平均(15.66±3.16)歲。此家系樣本用作GRM5基因研究的驗(yàn)證樣本。

本研究得到了山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得研究對象或其監(jiān)護(hù)人(父母)的知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備 抽取所有受試者的外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，采用酚－氯仿法提取基因組DNA。檢測DNA濃度后將所有DNA樣品稀釋至終濃度 20 ng/μL。

1.2.2 DNA混合池(DNA pooling)制作 對樣本1中的患者組與正常對照組的每個(gè)個(gè)體取20 ng/μL濃度的DNA溶液10μL進(jìn)行混合，分別構(gòu)建患者組與對照組DNA混合池。用于GRM5基因檢測的100個(gè)家系的DNA則稀釋到2 ng/μL濃度，采用Apricot Designs PP-96-M 96 Channel Multiple-Station Personal Pipettor進(jìn)行自動(dòng)化DNA移液，用96孔深孔板套裝200μL塑料管，大批量分裝5μL DNA溶液(10 ng)，－20℃冷凍后備用。

1.2.3 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位點(diǎn)的檢測 全基因組分析采用美國昂非(Affymetrix)公司的基因分型芯片Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片，包含906，600個(gè) SNPs與946，000個(gè)檢測拷貝數(shù)的探針。家系樣本則僅檢測GRM5基因的6 個(gè) SNP 位點(diǎn)，即 rs591849，rs16915130，rs3899716，rs2133395，rs597462，rs1942486。采用高分辨率溶解曲線(High Resolution Melting，HRM)檢測SNP位點(diǎn)的基因型。具體操作:PCR總反應(yīng)體系為12.5μL，200μL塑料試管內(nèi)含基因組 DNA 10 ng(5μL)，dNTPs(10 μmoL)0.25μL，10×PCR緩沖液1.25 μL，MgCl2+(25 μmoL)0.75μL，正向與反向引物(5μmoL)各 0.75 μL，Taq DNA 合成酶(Fermantas)0.5 U(5 U/μL)，SYTO9⑨ (5μmoL)3.75μL，石蠟油20μL封頂，以防蒸發(fā)。PCR反應(yīng)采用兩步法，預(yù)變性:94℃ 5 min，變性:94℃ 30 s，退火與延伸55℃～60℃ 1 min，50個(gè)循環(huán)，保溫72℃ 7 min，最后4℃保存。高分辨率溶解曲線基因分型(HRM genotyping)在Rotor-Gene 6000熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，變性94℃ 1 min，復(fù)性40℃3 min，然后開始緩慢升溫進(jìn)行高分辨率溶解檢測，升溫范圍65℃至85℃，升溫速度為0.1℃/s。

HRM基因分型采用Rotor-Gene 6000 series軟件1.7版本。雜合子由于異源雙鏈DNA存在，兩次解鏈呈現(xiàn)形狀特殊的曲線很容易被區(qū)分，剩下的兩種純合子由于解離溫度接近，有時(shí)難以區(qū)分，要達(dá)到對其進(jìn)行準(zhǔn)確無誤的基因分型，必須通過人工制造雜合子的方法。具體做法是:在第一次分型去除雜合子之后，選取一個(gè)已知分型為純合子個(gè)體的PCR產(chǎn)物，加入水稀釋1000倍后作為模版，進(jìn)行大量PCR擴(kuò)增后等量摻入所有純合子的PCR產(chǎn)物中，再次進(jìn)行高分辨率溶解曲線檢測。摻入外源性PCR產(chǎn)物之后，所有純合子中與摻入DNA的基因型不同那部分個(gè)體會(huì)變?yōu)殡s合子，而摻入與自身基因型相同的那些個(gè)體的基因型則保持純合不變，至此，兩種純合子被準(zhǔn)確無誤地分開。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 樣本1的基因分型文件中，每個(gè)SNP位點(diǎn)有兩個(gè)信號部分組成(Signal A與Signal B)，信號的強(qiáng)度反映了DNA混合池樣本中此位點(diǎn)的基因頻率。由于兩組DNA混合池中染色體的數(shù)量并不相等，因此將信號數(shù)值按照染色體組成數(shù)目進(jìn)行換算后，再通過Excel 2007軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。核心家系樣本的統(tǒng)計(jì)分析使用Haploview 4.1軟件，進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，單個(gè)位點(diǎn)的遺傳連鎖不平衡分析，單倍體構(gòu)建與χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 全基因組分析結(jié)果 89例精神分裂癥患者與

1000名對照的全基因組關(guān)聯(lián)分析表明，rs16915130位點(diǎn)與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)(χ2=39.895，P=2.68×10－10)。原始信號強(qiáng)度與等位基因轉(zhuǎn)換見表1。此位點(diǎn)恰好位于GRM5基因內(nèi)部。

2.2 核心家系的驗(yàn)證結(jié)果 100個(gè)核心家系的研究結(jié)果顯示，所進(jìn)行的 GRM基因內(nèi)5個(gè) SNP位點(diǎn)(rs591849， rs16915130， rs3899716， rs2133395，rs597462)與其右側(cè)的1個(gè)SNP位點(diǎn)(rs1942486)無論是單個(gè)位點(diǎn)還是單倍體均未發(fā)現(xiàn)與精神分裂癥關(guān)聯(lián)(P ＞0.05)。見表2、3與圖1。

3 討論

許多研究表明，谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)異常與精神分裂癥病理機(jī)制相關(guān)［9］。谷氨酸受體拮抗劑在人類可引起一過性精神癥狀，如:幻覺、妄想，以及陰性癥狀［10］。另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，谷氨酸能系統(tǒng)功能缺陷可引起類似精神分裂癥的癥狀。谷氨酸通過兩類受體調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng):離子型和促代謝型谷氨酸受體(GRM，mGluR)。離子型受體包括三個(gè)類型:NMDA受體，AMPA受體和紅藻氨酸受體。促代謝型谷氨酸受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體，它包括7個(gè)跨膜域和細(xì)胞外氨基末端區(qū)域，此受體分為三類［11］:Ⅰ類包括 mGluR1(GRM1)和mGluR5(GRM5)，這類受體與磷酸肌醇水解相關(guān)，并且能夠活化磷脂酶C(PLC)。Ⅱ類受體包括mGluR2(GRM2)和 mGluR3(GRM3)，Ⅲ類受體包括mGluR4(GRM4)，mGluR6(GRM6)，mGluR7(GRM7)和mGluR8(GRM8)。mGluR5(GRM5)受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布十分廣泛，主要分布于紋狀體、嗅結(jié)節(jié)、橫核、海馬、大腦皮質(zhì)［12］。GRM5 基因定位于 11q14［6］。本研究采用了GWAS和家系關(guān)聯(lián)對照研究對該基因與兒童精神分裂癥的關(guān)系進(jìn)行了探討。

表1 GRM 5基因rs16915130位點(diǎn)原始熒光信號強(qiáng)度與等位基因頻率轉(zhuǎn)換

表2 100個(gè)兒童與青少年精神分裂癥核心家系中GRM 5基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

表3 100個(gè)兒童青少年精神分裂癥核心家系中GRM 5基因SNPs位點(diǎn)的單倍體關(guān)聯(lián)分析

圖1 100個(gè)兒童青少年精神分裂癥核心家系中GRM5基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)的連鎖不平衡分析

本研究中采用的DNA混合池方法是一種通過把許多DNA樣本混合后對復(fù)雜遺傳病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的有效方法［13］。本課題組利用此方法已發(fā)現(xiàn)了8號染色體與精神分裂癥關(guān)聯(lián)、以及JARID2為精神分裂癥的易感基因［14－15］。

GWAS已廣泛用于精神分裂癥遺傳學(xué)研究，但是眾多的假陽性也相伴而來。從本課題組的研究結(jié)果來看，若以P值10－6作為標(biāo)準(zhǔn)，與精神分裂癥關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)高達(dá)3567個(gè)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，這遠(yuǎn)超過對精神分裂癥易感基因數(shù)目的預(yù)測。而本研究中對89例兒童青少年精神分裂癥與1000例正常對照的關(guān)聯(lián)分析雖然發(fā)現(xiàn)了陽性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)rs16915130，但在100個(gè)兒童青少年精神分裂癥核心家系卻未得到驗(yàn)證。須考慮芯片研究結(jié)果屬于假陽性，原因有二:第一，可能是DNA混合或者芯片實(shí)驗(yàn)誤差，然而這種可能較小，因?yàn)槲覀冇猛瑯臃椒ㄕ业搅薐ARID2基因?yàn)樯綎|省東部隔離人群的易感基因;第二，患者組與對照組遺傳結(jié)構(gòu)的差異(等位基因頻率差異)，這可能是最主要原因。而以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)分析是排除這種結(jié)果的有效方法，因?yàn)楦改傅倪z傳結(jié)構(gòu)直接傳遞給后代，從而避免了人群層化干擾。

關(guān)聯(lián)分析本質(zhì)是比較患者組與對照組之間等位基因、單倍體頻率的差異，但關(guān)聯(lián)不單可能是與病因有關(guān)，還可能與臨床異質(zhì)性、遺傳異質(zhì)性、等位基因異質(zhì)性等諸多原因相關(guān)，這是關(guān)聯(lián)分析中棘手的問題。不過，全基因組外顯子測序技術(shù)及全基因組測序技術(shù)可直接對DNA序列進(jìn)行比對，隨著這些技術(shù)的發(fā)展，在不久的將來可能可以繞過上述障礙，精神分裂癥易感基因的尋找有望得到突破。

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The genome-wide association and family based association studies of the GRM 5 gene with childhood and ado-lescent onset schizophrenia.

LUAN Meng，TANG Jian，CHEN Xing，ZHOU Peng，ZHANG Yan，LIU Jintong，LIUWenmin CHEN Gang.Laboratory of Medical Geneitcs，Institute of Basic Medicine，Shandong Academy of Medical Sciences.18877 Jingshi road，Jinan 250062，China.Tel:0531 －82919507.

ObjectiveTo verify the association between GRM5 gene and schizophrenia M ethods The genome wide association study(GWS)was performed on 89 childhood and adolescentonset schizophrenia and 1000 normal controls using affymetrix 6.0 microarray.Six single nucleotide polymorphism(SNP)(rs591849，rs16915130，rs3899716，rs2133395，rs597462 and rs1942486)were detected in 100 childhood and adolescent onset schizophrenia nuclear families using High-Resolution Melting(HRM)system.Haploview 4.1 software was used to analyzed alellic and haplotipic association of the SNPs.Results GWS revealed an association of rs16915130 with schizophrenia.However，no association were detected in either allelic or haplotypic analysis in those families(P＞0.05).Conclusions Our data have not confirmed the association of GRM5 genewith the etiology of childhood and adolescentonsetschizophrenia in Shandong province of China.

Schizophrenia Childhood and adolescent Metabotropic glutamate Single nucleotide polymorphism

R749.3

A

☆國家自然科學(xué)基金(編號:30770780，30440042);山東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號:Z2008C11)

* 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室(濟(jì)南250062)

E-mail:chengang@sdams.cn)△山東大學(xué)校醫(yī)院

※山東省精神衛(wèi)生中心

2010－12－24)

(責(zé)任編輯:曹莉萍)

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