胡德志 王曉梅 毛穎 周良輔

人橫紋肌樣腦膜瘤細胞株的分離和鑒定

胡德志*王曉梅*毛穎*周良輔*

目的 人橫紋肌樣腦膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)是一種少見的難治性中樞神經系統腫瘤。為建立其體外研究模型，本實驗擬從1例確診的橫紋肌樣腦膜瘤中分離和鑒定橫紋肌樣腦膜瘤細胞株。方法 利用貼壁培養(yǎng)和腫瘤球培養(yǎng)結合的方法，分離細胞株。利用流式細胞術分析表面抗原標志。用XTT法檢測細胞生長活性。用體內移植方法評估其致瘤能力。結果 分離培養(yǎng)得到一細胞株，其表面標志為CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－Cd34－，與間質前體細胞具有相似性。其在體外具有長期傳代能力，目前已經傳了50余代。體內移植試驗表明1×105以上細胞具有較一致的顱內致瘤能力，獲得的移植瘤與原發(fā)人腫瘤具有相似的組織學特征。結論 我們首次分離了1例具有間質細胞特征并具有致瘤性的橫紋肌樣腦膜瘤細胞株，為惡性腦膜瘤的研究提供了一個體外模型。

橫紋肌樣腦膜瘤 細胞株 間質細胞

橫紋肌樣腦膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)是WHO III級腦膜瘤的一種類型，是難治性腫瘤，經過手術切除輔以放、化療治療后，腫瘤仍易復發(fā)，預后差［1－3］。目前對該疾病的臨床和病理特征有一定的研究，但是對其發(fā)病機制卻罕有討論。這很可能與缺乏該腫瘤的實驗模型有關。通過本實驗，我們建立了首例人橫紋肌樣腦膜瘤的細胞株，為該腫瘤的研究提供了體外模型。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究征得患者同意以及復旦大學華山醫(yī)院倫理委員會批準。新鮮腫瘤標本來自1例59歲的男性橫紋肌樣腦膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)患者。磁共振顯示右中顱底有一注射造影劑后有強化的腫瘤，瘤周有中度水腫。術中見腫瘤基底在顱底硬膜，腫瘤全切除。術后切片病理檢查顯示局部有橫紋肌樣變的特征，表現為偏離中心的細胞核和偏多的嗜酸性染色的細胞漿。其他區(qū)域見不典型腦膜瘤的特征，包括局部上皮膜抗原(epithelialmembrane antigen，EMA)陽性染色，vimentin(VIM)陽性染色和高于10%的 Ki-67有絲分裂指數(圖 1)。GFAP，MNF116，HMB45，S-100，CK，desmin和 SMA染色陰性，可排除膠質瘤、黑色素瘤、轉移性肉瘤及不典型畸胎瘤。

圖1 人原發(fā)腫瘤組織學分析。A:人冠狀位MRI，可見有左中顱底明顯增強的腫塊;B:術中照片，腫瘤基底在中顱底硬膜;C:人腫瘤標本石蠟切片HE染色，見橫紋肌樣細胞，特征為細胞核偏中心分布，且胞漿巨大，嗜酸性;D，E，F:人腫瘤標本免疫組化染色，見腫瘤細胞局灶性表達EMA和VIM。Ki-67有絲分裂指數 ＞10%;C，D，E，F(× 400，Scale bar=100 μm)

1.2 細胞培養(yǎng) 采用的細胞培養(yǎng)液均為不含血清的DMEM(Gibco)，添加了 N2(1∶100，Sigma)，heparin(5μg/mL，Sigma)，EGF和 bFGF(均為 20 ng/mL，Sigma)，insulin(20 ng/mL，R＆D system)，B27(1%，Invitrogen)，以及 hLIF(100 ng/mL，R＆D system)。新鮮腫瘤組織在去除血管和蛛網膜后，經銳性碎化及膠原酶(0.1%，Sigma，37℃)分解后離心(2100 r/min，4℃)，棄上清重懸浮于200μL PBS，所獲得的單細胞懸液再經濾孔直徑為37μm細胞濾網 (Falcon)濾過。然后將此細胞接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶，接種密度為1×106細胞/cm2。24h后將非貼壁細胞去除，貼壁細胞3～4 d換液一次。待貼壁細胞成片后，胰酶消化傳代培養(yǎng)。傳到第四代時，將貼壁細胞消化后轉移到超低粘附六孔板，進行腫瘤球(tumor sphere)培養(yǎng)。細胞接種密度為3×105個/cm2。腫瘤球連續(xù)培養(yǎng)至第三代后收集腫瘤球，分散細胞，轉移至塑料培養(yǎng)皿再行貼壁培養(yǎng)。

1.3 流式細胞儀分析 使用流式細胞儀檢測分離培養(yǎng)的細胞的表面抗原［4］。細胞先與熒光素結合的抗體以及同型對照抗體一起孵育。洗滌后重新懸浮于1 mL HBSS中。在分析前添加 2μL propidium iodide(PI;Calbiochem，100μg/mL)。每種抗原分析重復5次實驗。

1.4 細胞動力學 細胞擴增活性用2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5Vsulfop henyl)-5-［(phenylamino)carbonyl］-2H-tetrazolium hydroxide(XTT)法［5］檢測，并繪制成細胞生長曲線。

1.5 體內移植試驗 收集對數生長期的細胞，制成單細胞懸液。10μL細胞懸液(含1×102～1×106細胞)注射到BALB/c裸鼠顱內。裸鼠出現明顯的消瘦以及神經系統癥狀時，處死裸鼠觀察有無移植瘤形成。移植瘤行切片分析了解其組織學特點。

1.6 組織病理分析 用HE染色和過氧化物酶染色法進行組織病理分析。石蠟切片脫蠟后在檸檬酸鹽緩沖液(PH 6)中以微波加熱，并以3%BSA封閉非特異性抗體后與一抗(EMA 1∶100，Signet;VIM 1∶200，Covance;SOX2 1∶100，Abgent;Ki-67 1∶100，Saierbio;GFAP 1∶100，Abgent;SMA 1∶100 Abcam，ScienCell;desmin 1∶100，Biolabs;MNF116 1∶100，Abcam;HMB45 1∶100，Abcam;CK 1∶200，Abcam)孵育過夜，與生物素結合的二抗作用30 min，再與過氧化物酶復合物作用30 min。設對照(不加一抗)。

1.7 細胞染色體分析 按照文獻［6］方法進行細胞遺傳學分析。利用彩色熒光原位雜交(M-FISH)對間期、中期染色體進行處理、照相，再進行核型分析和染色體異常分析。

2 結果

2.1 細胞株RM-A的分離 我們將原代細胞接種于添加了上述一些生長因子的無血清培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基不適合分化細胞的生長。20～30 d后，貼壁細胞長成片。3～4代后，貼壁細胞呈現成纖維樣或扁平樣形態(tài)，并觀察到不少腫瘤球樣的細胞球(圖2A，B)。為了獲得大量的腫瘤球，我們將貼壁細胞分散制成單細胞懸液，并轉種到超低粘附六孔板。15d后觀察到許多懸浮腫瘤球，其直徑介于50～500μm(圖2C，D)。

圖2 原代細胞貼壁培養(yǎng)和腫瘤球培養(yǎng)。原代腫瘤細胞在無血清培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)傳代后，再轉移至超低粘附六孔板行腫瘤球培養(yǎng)。A:原代培養(yǎng)的貼壁細胞。在塑料培養(yǎng)瓶里，接種30 d后，貼壁細胞長成片;B:在貼壁細胞傳代培養(yǎng)后，可以觀察到貼壁的腫瘤球;C，D:在超低粘附六孔板中的懸浮腫瘤球。將貼壁細胞轉移到超低粘附六孔板中以同樣培養(yǎng)液培養(yǎng)，15 d內形成許多懸浮的腫瘤球。(×100，Scale bar=50μm)

將腫瘤球連續(xù)培養(yǎng)，第三代后重新收集于塑料培養(yǎng)瓶中貼壁、擴增，該培養(yǎng)系統至今已經超過50代的傳代，倍增時間約3～4 d。將該細胞培養(yǎng)物命名為RM-A。XTT法測得的RM-A細胞生長曲線如圖所示(圖3)。

2.2 RM-A細胞表面抗原檢測 用流式細胞儀檢測發(fā)現CD59和CD44在所有細胞表達;CD31，CD11a和CD34在所有細胞均不表達;CD105表達率介于18.3%～25.7%(圖4)。除CD105表達較低，這種表面抗原組合與以往在間質干細胞中發(fā)現的相似。

2.3 RM-A細胞致瘤能力 1×105及 以上細胞注射到裸鼠顱內后，可以觀察到致瘤性。接受1×105注射的6只裸鼠，有4只產生了顱內腫瘤。而1×104及以下細胞注射到顱內后則沒有觀察到致瘤性。移植瘤的組織病理分析發(fā)現:①橫紋肌樣變;②VIM和 EMA染色陽 性;③ GFAP，MNF116，HMB45，S-100，CK，desmin和SMA染色陰性。見圖5。

2.4 RM-A細胞的染色體異常 對RM-A的染色體分析發(fā)現有二倍體、四倍體和非整倍體。進一步的分析發(fā)現有廣泛的染色體異常，但最常見的是1號、11號和22號染色體異常。見圖6。

圖3 XTT法測得的細胞生長曲線。Error bar表示標準誤

圖5 接種瘤的組織學分析。A:顱內接種RM細胞后20d產生的接種瘤。B，C，D:裸鼠腦組織切片HE染色，可見橫紋肌樣細胞。E，F:接種瘤石蠟切片免疫組化分析發(fā)現EMA和VIM的局灶性表達。B(× 10，Scale bar=10μm);C(× 40，Scale bar=20μm);D，E，F(× 400，Scale bar=100μm)

圖6 對一個四倍體核型的中期染色體分析結果:80＜4n＞，XXYY，－1，der(1)t(1;6)(p10;p?10).fishder(1)t(1;6)(wcp1+，wcp6+)，－5，+7，－8，－9，－10，－10，der(11)t(11;20)(q?23;q12).fishder(11)t(11;20)(wcp11+ ，wcp20+)，－ 12，der(12)t(12;y)(?;?).fishder(12)t(12;y)(wcp12+，wcpy+)，－13，－14，－14，－15，－15，der(15)t(12;15)(q?;12q?23).fishder(15)t(12;15)(wcp12+，wcp15+)，der(15)t(12;15)(q?;12q?23).fishder(12)t(12;15)(wcp12+，wcp15+)，+16，－17，－19，－19，－19，－22，+mar1.fishder(?5)t(5;22)(wcp5+，wcp22+)，+mar2.fishder(13)t(13;1;15)(wcp13+，wcp1+，wcp15+)，+mar2.fishder(13)t(13;1;15)(wcp13+ ，wcp1+ ，wcp15+)

圖4 流式細胞儀檢測結果。L分別為CD59，CD44，CD105，CD11a，CD31，CD44;R表示同型對照。

3 討論

作為惡性腦膜瘤的一種亞型，橫紋肌樣腦膜瘤的臨床病理特征已經有不少報告。但是由于缺乏穩(wěn)定的研究模型，限制了對其發(fā)病機制的深入研究。而本研究則從1例橫紋肌樣腦膜瘤的新鮮標本中分離了具有致瘤性的細胞株。

迄今為止見于報道的腦膜瘤細胞株非常少。良性腦膜瘤由于其細胞分裂緩慢的特點，其建株必須將細胞作永生化處理，因此難以反應自然的真實的細胞活動狀態(tài)，在科研活動中應用價值不高［7］。目前在研究中應用較廣的是Lee等多年前建立的惡性腦膜瘤細胞株［8］。Lee的細胞株建立之時，腦膜瘤的病理分型與如今是有很大不同的。近年腦膜瘤病理分型趨于細化，增加了諸如橫紋肌樣腦膜瘤等新的病理類型。因此，回頭看Lee的細胞株，不能確定其來源腦膜瘤的確切病理類型。本細胞株的一個重要特點是，它明確代表了橫紋肌樣腦膜瘤。

本細胞株另一個重要特點是其具有間質細胞特征的表面抗原組合。這在以往的腦膜瘤細胞株中從未見過描述。這一發(fā)現的意義在于表明橫紋肌樣腦膜瘤很可能是上皮－間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的產物。腦膜瘤被認為起源于蛛網膜細胞。那么，蛛網膜細胞是如何轉化為腦膜瘤細胞的?有研究發(fā)現，在神經纖維瘤病II型(neurofibromatosis type 2，NF2)基因缺失的老鼠中，腦膜瘤發(fā)病率非常高。NF2基因編譯一種被稱為Merlin的蛋白分子，而Merlin的缺失則導致EMT［9］。EMT是許多腫瘤發(fā)生的早期過程。當然，若要證實橫紋肌樣腦膜瘤是EMT的產物，必須建立蛛網膜細胞通過EMT誘導轉化為腦膜瘤細胞的模型，本研究則只是提供了這種推論的一個重要證據。

用于建立本細胞株的細胞培養(yǎng)方法也有別于其他腦膜瘤細胞株。即我們采用了目前用于分離腫瘤干細胞常用的無血清腫瘤球培養(yǎng)方法。目前，有不少實體瘤的腫瘤干細胞均是采用這種方法分離得到的［10］。從采用的方法來看，我們獲得的細胞株可能具有腫瘤干細胞的性質。本研究的局限是，尚未對建立的細胞株進一步進行克隆化培養(yǎng)，多潛能分化誘導試驗，以及該腫瘤的其他細胞群的比較研究，而這些都是鑒定腫瘤干細胞必需的工作。但是，我們的研究應該能說明一點:即橫紋肌樣腦膜瘤如果存在腫瘤干細胞，很可能這些干細胞就屬于表型為CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－Cd34－的細胞群中。

染色體分析獲得的數據，符合既往在腦膜瘤中發(fā)現的染色體異常。良性腦膜瘤常見22號染色體異常，非良性腦膜瘤染色體異常則更廣泛，尚涉及1號，11號等許多染色體。我們所做的核型分析還有一個意義，說明我們的細胞株不是來源于腫瘤中所夾雜的正常間質性支持組織，因為正常的間質支持組織不可能具有如此廣泛的染色體異常。

總之，本研究從橫紋肌樣分離了具有較清晰的表面抗原特征，具有較強致瘤性一個細胞群。對于惡性腦膜瘤的發(fā)病機制的研究，提供了一個新的的體外模型。

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The establishment of human rhabdoid meningioma cell line.

HU Dezhi，WANGXiaomei，MAO Ying，ZHOU Liangfu.Department of Neurosurgery，Huashan Hospital，No.12 Wulumuqizhong Road，Shanghai200040，China.Tel:021 －52889999.

ObjectiveHuman rhabdoid meningioma(RM)is a rare but intractable tumor.To establish amodel for in vitro research，we attempt to establish a cell line from a RM sample.M ethods A combination of plastic adherence method，tumor sphere propagation were employed to establish the cell line.The cell surfacemarker profile，the cell proliferative activity，and the tumorigenic ability of this cell line were examined using flow cytometry analysis，XTT assay，and in vivo experiments respectively.Results The established cell line displayed a CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－CD34－phenotypewhich was similar tomesenchymal progenitors.The cell line has been passed formore than 50 generations so far.In vivo experiments showed that the RM cell line could successfully establish exnograft tumors in nudemicewhen injected at great than 1×105cells intra-cranially.The xenograft tumors exhibited histological features identical to the human original tumor.Conclusions We have successfully established a rhabdoid meningioma cell line with mesenchymal traits and tumorigenic ability from human brain.

Rhabdoid meningioma Cell line Mesenchymal cells

R651

A

* 上海復旦大學附屬華山醫(yī)院神經外科(上海 200040)

E-mail:yingmao168@hotmail.com)

2011－03－03)

(責任編輯:甘章平)

·綜 述·