王超,孫天勝,姜京城,葉超群

大鼠頸段紅核脊髓束損傷后炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達譜

王超,孫天勝,姜京城,葉超群

目的探討大鼠頸段紅核脊髓束(RST)損傷后急性期炎癥反應(yīng)的分子機制。方法Sprague Dawley(SD)雌性大鼠18只,隨機分為2組:雙側(cè) RST損傷組(n=9)和假手術(shù)對照組(n=9)。制作雙側(cè) RST損傷模型,24 h后處死動物,以損傷處為中心取長約0.5 mm脊髓組織,將各組中的3只動物標本混合,提取總RNA,共得到6份RNA樣品,使用含有28000個大鼠基因的 Affymetrix表達譜基因芯片檢測基因變化。結(jié)果大鼠RST損傷后24 h表達發(fā)生變化的有153條基因,表達上調(diào)的有136條,表達下調(diào)的有17條。與炎癥相關(guān)的基因大部分表達上調(diào)(Scn9α除外),Toll樣受體信號途徑中有8條基因表達上調(diào)。結(jié)論RST損傷后多種炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達出現(xiàn)變化。

脊髓損傷;紅核脊髓束;基因芯片;大鼠

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后的炎癥反應(yīng)是當前研究的一個熱點。各種炎癥細胞如小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和各種細胞因子對SCI的發(fā)展各有利弊[1]。SCI可以引起血脊髓屏障的破壞,使免疫細胞從血中進入脊髓。中性粒細胞或巨噬細胞的浸潤以及脊髓中的小膠質(zhì)細胞不利于SCI后的恢復(fù)[2-3]。中性粒細胞釋放的神經(jīng)毒性因子包括金屬蛋白酶、活性氧自由基和腫瘤壞死因子,巨噬細胞釋放的神經(jīng)毒性因子尚不明確[4]。中性粒細胞和神經(jīng)元的直接接觸也可以增強神經(jīng)毒性[5],T細胞[6]可以加重軸突的損傷,使軸突脫髓鞘,失去功能。然而另一方面,在SCI后巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和T細胞也可以分泌一些因子起到神經(jīng)保護和促進再生的作用[7-8]。這些結(jié)論說明,SCI后的炎癥反應(yīng)可能起到雙重作用。目前對于神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的研究較少。本研究使用基因芯片技術(shù)檢測大鼠一個下行傳導(dǎo)束——紅核脊髓束(rubrospinal tract,RST)損傷后24 h炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達變化,從基因水平揭示RST損傷后炎癥反應(yīng)的深層機制,可能會以SCI后的炎癥反應(yīng)作為新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雌性(SD)大鼠18只,體重200～230 g,平均220 g。隨機分成兩組:雙側(cè)RST損傷組和假手術(shù)對照組,每組9只。

1.2 RST損傷模型制備 大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液,按0.3 ml/100 g麻醉成功后,俯臥位固定于操作臺,外科常規(guī)消毒、鋪無菌巾,手指觸摸確定C2棘突為標志,以C3棘突為中心沿背側(cè)正中線做20～30 m縱向切口,切開皮膚及皮下組織,鈍性分離肌肉,暴露C2-4節(jié)段椎板,用自制微型咬骨鉗從C3-4椎板間隙進鉗,輕輕向上咬除整個C3椎板及兩側(cè)關(guān)節(jié)突,嚴格止血,暴露脊髓硬脊膜及雙側(cè)神經(jīng)根。將大鼠俯臥位固定于立體定位儀上,在冷光源顯微鏡直視下用顯微外科剪剪開脊髓硬脊膜,探查雙側(cè)神經(jīng)根后根,以其為標志,用自制寬度0.6 mm的損傷刀片調(diào)整至其腹側(cè),與立體定位儀水平面呈25°角插入脊髓,深度0.8 mm,為確保損傷完全,反復(fù)插入多次并留刀3～5 min,以同種方法損傷對側(cè)RST。拔出刀片,0.9%氯化鈉注射液沖洗,嚴格止血,局部給予適量青霉素后逐層縫合筋膜、皮膚碘附消毒傷口。

1.3 取材及RNA提純 術(shù)后24 h,將各組大鼠麻醉,用0.9%氯化鈉注射液200 ml心臟灌流處死。以損傷處為中心,迅速取出長度約5 mm脊髓組織放入凍存管中,將凍存管投入液氮中保存。各組中3只大鼠的樣本混合得到一份樣品,共得到6份樣品。采用 Trizol一步法提取組織中的總RNA,通過醇沉淀法濃縮RNA,并進一步采用Qiagen RNeasy MinElute Cleanup Kit對總 RNA進行過柱純化,分光光度計定量,1.5%甲醛變性電泳檢測RNA,一共得到6份RNA樣品。送北京博奧生物有限公司(生物芯片北京國家工程研究中心)進行基因檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用Standford大學(xué)開發(fā)的基因芯片顯著性差異分析 (Significance Analysis of Microarray,SAM)軟件篩選差異基因,Fold change＞2.0或＜0.5為表達發(fā)生差異的基因。使用博奧生物有限公司提供的分子功能注釋系統(tǒng)、GenBank數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因與基因組百科全書)、GO數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology,基因本體論)對這些差異基因進行分析。

2 結(jié)果

2.1 總 RNA提取結(jié)果 RNA樣品總量≥15 μ g,RNA純度:A260/280≥1.80,RNA完整性:經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測,RNA樣品電泳條帶清晰,28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近1∶1,樣品純度、總量及完整性均符合Affymetrix表達譜芯片檢測要求。

2.2 基因芯片分析結(jié)果 大鼠頸段RST損傷后24 h表達發(fā)生變化的有153條基因,其中表達上調(diào)的有136條,表達下調(diào)的有17條。使用GO數(shù)據(jù)庫對差異基因進行分析,發(fā)現(xiàn)表達發(fā)生變化的炎癥相關(guān)基因大部分為表達上調(diào),僅Scn9α表達下降(表1～表3),Toll樣受體(TLRs)信號途徑中有8條基因表達發(fā)生變化,均為表達上調(diào)(表4)。

表1 GO:0006954炎癥反應(yīng)差異表達基因

表2 G O:0030593中性粒細胞趨化差異表達基因

表4 Toll-樣受體信號通路差異表達基因

表3 GO:0030595白細胞趨化差異表達基因

3 討論

SCI后會引起功能受限,甚至殘疾,并帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。目前對于SCI尚無有效的治療方法。脊髓獨特的構(gòu)造和功能分布使得局部的損傷可以對肢體遠端的功能產(chǎn)生影響。脊髓灰質(zhì)損傷是節(jié)段性的,只局限于損傷節(jié)段的灰質(zhì)支配的區(qū)域。而脊髓白質(zhì)是由上、下行傳導(dǎo)束組成的,其損傷可以對損傷節(jié)段以下的感覺和運動均產(chǎn)生影響,所以臨床癥狀的影響主要決定于白質(zhì)中傳導(dǎo)束的損傷程度。過去的研究主要使用原位雜交、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、免疫組化等生物技術(shù),在同一時間僅能研究幾個基因的變化,不能適應(yīng)現(xiàn)代高通量的研究要求。本實驗使用含有28000個大鼠基因的Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array表達譜芯片對大鼠頸段RST損傷后24 h的基因表達變化進行檢測,為進一步闡明傳導(dǎo)束損傷后炎癥反應(yīng)的深層機制打下基礎(chǔ)。

GO數(shù)據(jù)庫在生物信息學(xué)領(lǐng)域中已被廣泛使用,被用來解釋真核基因及蛋白在細胞內(nèi)所扮演的角色,它包括3個分支:生物過程、分子功能和細胞組件。將RST損傷后24 h發(fā)生的基因表達變化使用GO數(shù)據(jù)庫分析后,發(fā)現(xiàn)涉及炎癥反應(yīng)、中性粒細胞趨化和淋巴細胞趨化的基因表達變化,除Scn9α外,其他基因的表達均上調(diào),主要包括多種趨化因子配體如Cxcl10,Cxcl3,Ccl3,Cxcl2,Cxcl1,Ccl7等,以及趨化因子配體Ccr1,其中Cxcl10的上調(diào)幅度最大,有的趨化因子在GO數(shù)據(jù)庫中同時參與多種功能。趨化因子在白細胞的遷移中扮演重要角色[9],吸引中性粒細胞、單核/巨噬細胞等炎性細胞移動到病灶,增強炎性細胞的吞噬殺傷功能,促進它們釋放炎癥介質(zhì)和炎癥蛋白。有文獻報道它還在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要作用[10],神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞在不同的條件下均可以表達趨化因子及其受體,調(diào)節(jié)發(fā)育和突觸信號傳遞。Cxcl10表達上調(diào)的程度最高,它的功能[11]包括對單核/巨噬細胞、T細胞、自然殺傷細胞和樹突細胞的趨化作用,促進T細胞黏附到內(nèi)皮細胞,促進血管生成。

T LRs在天然免疫中扮演著重要角色,T LR的激活可以引起炎癥反應(yīng)已經(jīng)是大家所公認的。最近有研究表明,創(chuàng)傷或缺血后釋放的某些內(nèi)源性因子也可以激活 TLR受體,T LR4可以激活NF k-B信號通路[12],從而啟動多種促炎因子的轉(zhuǎn)錄,如一氧化氮合酶,環(huán)加氧酶,金屬蛋白酶9和黏附分子[13]。它可以稱為感知組織損傷的哨兵,在損傷引起的局部炎癥反應(yīng)中具有重要作用。使用KEGG對結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn),RST損傷后24 h TLRs信號通路中有8個基因表達上調(diào),其中包括趨化因子 Ccl3、Cxcl9、Cxcl0、Cxcl1,表明在RST損傷后 TLRs信號通路已被激活,趨化因子在TLRs激活的炎癥反應(yīng)中起著重要作用。

本研究結(jié)果顯示,RST損傷后炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的變化和T LRs信號通路相關(guān)的基因變化。由于基因芯片高通量的特性使其準確性較差,下一步我們將采用RT-PCR技術(shù)對這些基因的表達變化進行驗證,然后進一步檢測其在損傷后不同時間點的表達變化,從而為深入研究脊髓傳導(dǎo)束損傷后炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展過程打下基礎(chǔ)。

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Inflammation Response Related Gene Expression Profile after Injury of Rubrospinal Tract

WANG Chao,SUN Tian-sheng,J IANG Jing-cheng,et al.Department of Orthopedics,Beijing Army General Hospital,Chinese PLA Postgraduate Medical School,Beijing 100700,China

ObjectiveTo investigate the characteristic changes of expression of the genes related to inflammation response after injury of rubrospinal tract(RST).Methods18 Sprague Dawley(SD)female rats were randomly divided into 2 groups:RST injury group(n=9)and Sham group(n=9).RST injury models were established,and the rats were killed 24 hours after injury.5 mm length spinal cord was harvested from the epicenter and total RNA was extracted.Affymetrics Gene Chips for rats,representing 28000 genes,were used for mRNA expression profiling.Results153 transcripts were observed to differ(2.0 fold;136 up-regulated and 17 down-regulated)after injury of RST,compared with sham group.M ost of genes related to inflammation response were upregulated(except Scn9α).8 genes related to Toll-like receptor signaling pathway were also up-regulated.ConclusionSignificant changes related to inflammation response occur in acute phase after injury of RST.

spinal cord injury;rubrospinal tract;gene chip;rat

[本文著錄格式]王超,孫天勝,姜京城,等.大鼠頸段紅核脊髓束損傷后炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達譜[J].中國康復(fù)理論與實踐,2011,17(4):337—339.

北京軍區(qū)總醫(yī)院骨科,解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院,北京市100700。作者簡介:王超(1982-),男,山西呂梁縣人,在讀碩士研究生,醫(yī)師,主要研究方向:脊髓損傷。通訊作者:孫天勝(1964-),男,河北滄州市人,碩士,主任醫(yī)師,教授,主要研究方向:脊髓損傷。

R364.5,R744

A

1006-9771(2011)04-0337-03

2011-03-16)

·綜述·