段紅梅,楊朝陽,李曉光

以往的觀點認為,干細胞只能向其來源方向的細胞衍生。這一觀點嚴重限制了干細胞的應用。近年的研究成果證實,骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)在體外誘導可以向3個胚層的細胞分化[1-5]。為此,研究者采用二甲基亞砜(DMSO)、叔丁對甲氧酚(BHA)、β-巰基乙醇等各種誘導劑,單獨或聯合應用來促使 MSCs的分化[6-7]。近幾年,在誘導過程中添加各種細胞生長因子引起人們的關注。堿性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)是其中的一種。研究證明,bFGF可以調控神經干細胞的更新和分化,在應用bFGF 1 d后就可以起始分化[8]。本實驗主要探索MSCs經殼聚糖-bFGF載體的誘導后定向分化為神經細胞的潛能及誘導產生的細胞,并通過神經細胞的特征標記物和神經細胞的形態(tài)來驗證。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 出生7 d的Wistar乳鼠由首都醫(yī)科大學實驗動物中心提供。試劑：α-M EM培養(yǎng)基(Applichem)、Nestin 小鼠單克隆抗體(Chemicon,CA)、βtubulinⅢ兔單克隆抗體(Chemicon,CA)和MAP-2鼠單克隆抗體(Chemicon,CA)。

1.2 MSCs的分離培養(yǎng) 無菌冰凍麻醉條件下取出生7 d的Wistar大鼠股骨和脛骨,去掉骨表面的肌肉筋膜,用PBS(0.01 mol/L)將骨沖洗干凈。將骨放入含15%胎牛血清(FBS)的α-M EM培養(yǎng)基中,用小剪刀將骨髓鉗出,再將股骨端骨松質剪掉一部分,在膝關節(jié)端用5號針頭插孔,2 ml無菌注射器徹底沖洗骨髓腔;再用5號針頭注射器反復沖打骨髓細胞,使之成為單細胞懸液,將骨髓細胞懸液以1∶1比例,輕輕順離心管壁加在淋巴細胞分離液之上,1000 r/min,離心10 min分離單個核細胞。去掉頂層脂肪,吸取細胞膜層上部分,用含15%FBS的α-MEM培養(yǎng)基洗滌2次,1000 r/min,離心 10 min。沉淀細胞用含 15%FBS的α-MEM培養(yǎng)基充分分散細胞,計數。接種(1～3)×107/10 ml培養(yǎng)液含15%FBS的α-M EM培養(yǎng)基,90 mm塑料培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)于37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內孵育。24 h后全量換液,以后每3天全量換液1次,以去掉造血細胞干擾。連續(xù)培養(yǎng)7 d后,當基質細胞長滿培養(yǎng)皿80%時,用0.25%胰酶消化基質細胞,按1∶2傳代培養(yǎng),直至進入指數生長期,可以規(guī)則傳代。

1.3 MSCs的鑒定 MSCs在連續(xù)培養(yǎng)到3～6代后對其進行鑒定。用0.25%胰酶將貼壁的MSCs從塑料皿底部消化下來,4℃1000 r/min離心5 min,棄上清,然后用PBS洗2遍,4℃1000 r/min離心5 min棄上清,離心管底部留200μl的液體分別加入：PE-Cy5標記的小鼠抗大鼠的CD45單克隆抗體(BD Pharmingen)、FITC標記的小鼠抗大鼠的CD90單克隆抗體(BD Pharmingen)一抗;FITC標記的小鼠抗大鼠的CD44單克隆抗體(BD Pharmingen),PE-Cy5標記的小鼠抗大鼠的CD45單克隆抗體(BD Pharmingen)一抗;30 min后流式細胞儀(COUL TER EPICS@XL,Amercia)檢測。

1.4 MSCs的誘導分化 將第3代MSCs的細胞培養(yǎng)于鋪有蓋玻片的6孔板內,分別加入不同的誘導劑,實驗組1：單純殼聚糖(4 mg/ml);實驗組2：單純 b FGF(25 ng/ml);實驗組3：殼聚糖-b FGF載體(4 mg/ml);對照組：只加培養(yǎng)基(5 mlα-MEM培養(yǎng)基),培養(yǎng)于37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內孵育,每3天半量換液1次,連續(xù)培養(yǎng)。

1.5 免疫組化染色 以上各組的細胞在誘導后9 d、14 d、21 d,吸出培養(yǎng)基 ,PBS(0.01 mol/L)洗 3 次 ,每次5 min;4%多聚甲醛,4℃固定40 min,PBS洗3次,每次 5 min;0.3%PBST浸泡 5 min,1%羊血清(0.3%PBST配制)封閉30 min;入一抗：Nestin(1∶100),β-tubulinⅢ(1∶100),37℃,孵育90 min,PBS漂洗同上,入熒光二抗(1∶100)避光,37℃,孵育60 min,PBS洗 3次,每次 5 min,Hochest：染核(1∶100),30 min,去離子水漂洗3次,每次5 min,封片。

MSCs誘導14 d后,吸出培養(yǎng)基,0.01 mol/L PBS洗3次,每次5 min;4%多聚甲醛,4℃固定40 min;PBS洗3次,每次5 min;3%雙氧水,室溫避光10 min;0.3%PBST洗 3次,每次 5 min;1%羊血清(0.3%PBST配制)封閉20 min;入MAP-2一抗(1∶800),37℃,孵育60 min;PBST洗 3次,每次 5 min;二抗(1∶300),37 ℃,孵育40 min;PBST洗3次,每次5 min;三抗(1∶300),37 ℃,孵育40 min;PBST洗3次,每次5 min;DAB呈色,相差顯微鏡(IX71 Olympus,Tokyo,Japan)觀察。

1.6 Western blot 分別收集殼聚糖-b FGF載體誘導后 7 d、9 d、14 d、21 d 的細胞 ,4℃,12000 r/min 離心15 min,加入細胞裂解液,冰上裂解 30 min;4℃,12000 r/min離心15 min,取上清,BCA法蛋白定量,并制成蛋白含量為4.0 g/L的電泳樣品,取5μl(20μg總蛋白)用8%SDS-PA GE進行電泳,聚集膠：80 V,50 min;分離膠：100 V,90 min。電泳結束后,進行蛋白質轉膜：孔徑0.22μm的硝酸纖維素膜(NC),4℃,電流200 mA,150 min。Western blot雜交步驟：10%脫脂牛奶封閉NC膜1 h,TTBS(20 mmol/L Tris-HCl,p H7.5;0.15 mmol/L NaCl;0.05%Tween20)漂洗3次,每次10 min,與MAP-2一抗(1∶1000)雜交反應3 h,TTBS漂洗同上,再將NC膜與辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠二抗(1∶4000)雜交反應1 h,之后用 TTBS漂洗 NC膜3次,每次10 min,加入 ECL試劑吹打3 min,保鮮膜包裹,暗室進行 X-光膠片曝光、顯影和定影。

1.7 細胞活性的檢測 用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide,SIGMA)比色法檢測細胞活性。96孔板中每個孔內加入200μl細胞懸液,接種細胞數為104個;實驗分組：單純殼聚糖組(4 mg/ml)、單純 bFGF組(25 ng/ml)、殼聚糖-bFGF載體組(4 mg/ml)和單純培養(yǎng)基組。每組6個重復樣本,細胞每3天半量換液1次。細胞在誘導1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d 后 ,每孔加入20μl的0.1 M M TT(無血清培養(yǎng)基配制,p H 7.2),孵育 4 h后,吸干上清,每孔內加入 160μl的DMSO振蕩10 min,酶標儀570 nm檢測吸光值。

1.8 統(tǒng)計分析 X-光膠片的結果應用 Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描后,用Quantity One分析軟件進行定量分析;所有的數據資料以(ˉx±s)表示,統(tǒng)計處理采用SPSS 16.0軟件包進行方差分析(ANOVA)。

2 結果

2.1 MSCs鑒定 典型的MSCs呈扁平形、梭形、三角形細胞,當細胞接近鋪滿時呈現出成纖維細胞樣(圖1)。流式結果顯示,97%以上的細胞為CD44+/CD45-、CD90+/CD45-,證明從股骨和脛骨的髓腔內提取的細胞在傳3～6代后90%以上的細胞為MSCs。見圖2～圖3。

2.2 免疫組化染色 MSCs在殼聚糖-bFGF載體誘導9 d和14 d后表達神經干細胞標記物Nestin和神經細胞的標記物β-tubulin Ⅲ(圖6、圖9);單純殼聚糖組(圖4、圖7)和單純 bFGF組(圖5、圖8)僅少量細胞表達β-tubulinⅢ和Nestin;MSCs在殼聚糖-b FGF載體誘導14 d后83.54%細胞表達神經細胞的標記物βtubulin Ⅲ(圖 9)。

MSCs在誘導14 d后,免疫組化染色觀察到：殼聚糖-b FGF載體組有大量 MAP-2陽性細胞(圖 10、圖11),單純殼聚糖組(圖12),單純 bFGF組(圖13)僅有少量陽性細胞。表明MSCs誘導14 d后,可以分化為成熟神經細胞,且形成神經細胞的比例明顯高于單純殼聚糖組和單純bFGF組。

2.3 細胞活性的檢測 細胞活性通過M TT比色法測定,誘導1 d后在細胞活性方面3組無顯著性差異(P＞0.05)。誘導 3 d、7 d、14 d、21 d后殼聚糖-bFGF組細胞活性明顯高于單純殼聚糖組和單純b FGF組,誘導3 d、7 d后單純b FGF組細胞活性明顯高于單純殼聚糖組(P＜0.01)。誘導28 d后3組細胞活性無顯著性差異(P＞0.05)。見圖14。

2.4 Western blot MSCs經殼聚糖-bFGF誘導后7 d有少量表達MAP-2,隨著誘導時間延長MAP-2的表達量逐漸升高,且在14 d后達到穩(wěn)定(圖15、圖16)。

3 討論

近幾年很多研究都把目光集中在一些因子對干細胞的增殖和分化作用上,這些因子包括介質中彌散因子[8-9]和參與細胞間相互作用的因子[10-11]。它們可以增強或抑制干細胞的增殖和分化。例如：一直都認為bFGF是神經干細胞(NSC)增殖和分化的一個關鍵調節(jié)因子[12],并且可以促進MSCs和間充質祖細胞向神經細胞分化[13]。研究表明,在缺乏b FGF的小鼠中觀察到存在神經缺陷。這一結果證實,bFGF在神經發(fā)生中具有十分重要的作用[14]。

在本實驗中,殼聚糖-bFGF載體可以定向誘導MSCs向神經細胞分化,且誘導比例明顯高于單純bFGF組和單純殼聚糖組。其中單純殼聚糖組分化的比例最低。產生這一現象主要原因為：bFGF加入培養(yǎng)基中很快失去活性,此時被誘導的細胞不能得到持續(xù)的b FGF的作用;殼聚糖-b FGF載體對b FGF具有緩釋作用,能夠長時間緩慢釋放bFGF[15],保證bFGF在培養(yǎng)基中持續(xù)發(fā)揮作用,使細胞長時間保持在穩(wěn)定而持續(xù)的誘導狀態(tài)中,提高被誘導細胞向神經細胞分化的比例,殼聚糖-b FGF載體對b FGF的緩釋作用,在保證高效率誘導的同時又減少bFGF因子的浪費。

細胞黏附分子CD44、CD90是MSCs的表面標志性抗原,白細胞標志抗原CD45是造血干細胞的表面標志性抗原之一。因此,CD44+/CD45-、CD90+/CD45-細胞被認為是骨髓間充質細胞。本實驗的流式結果顯示,97%以上的細胞為CD44+/CD45-、CD90+/CD45-,證明從股骨和脛骨的髓腔內提取的細胞在傳3～6代后90%以上的細胞為MSCs。為了驗證殼聚糖-b FGF載體可以使MSCs分化為神經細胞,本實驗采用免疫組化染色間接分析各時間點分化細胞的表型。β-tubulinⅢ和MAP-2是成熟神經細胞的標記,Nestin是神經干細胞的標記。形態(tài)學和分子水平上的結果均顯示,MSCs經殼聚糖-bFGF載體誘導后表達神經細胞的標記物,且在誘導14 d后大量表達成熟神經細胞的標記物MAP-2。證明殼聚糖-bFGF載體可以誘導MSCs形成成熟神經細胞。

M TT是定量測定細胞活性的一種實驗方法,也是當前檢測生物材料的生物相容性和細胞毒性的主要方法[16]。本實驗采用殼聚糖和MSCs共培養(yǎng),目的是為了研究殼聚糖載體是否對干細胞具有細胞毒性和誘導作用。從M TT的結果可以看出,單純殼聚糖對干細胞無細胞毒性,不會抑制干細胞的分化;單純殼聚糖組和殼聚糖-b FGF載體組在誘導28 d后細胞活性并無顯著性差異(P＞0.05)。

本實驗得出,應用殼聚糖-bFGF載體可以誘導MSCs高比例向類神經細胞樣細胞分化(83.54%)。關于誘導形成神經細胞是興奮性還是抑制性,誘導產生的神經細胞是否有功能,及其誘導分化的機制等問題,仍需要進一步驗證和探索。

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