孔妍,唐強(qiáng),,朱路文,劉波

缺氧缺血性腦損傷后針康法對幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的影響

孔妍1,唐強(qiáng)1,2,朱路文1,劉波2

目的探討針康法對缺氧缺血性腦損傷(HIBD)幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬微管相關(guān)蛋白-2(M AP-2)的影響。方法將80只Wistar幼鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組和針康組,每組 16只。每組再按造模后 14 d、28 d分別處死分為2個(gè)亞組,每組8只。采用結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈,吸入氧體積濃度為8%的氧氮混合氣體,制作HIBD新生動(dòng)物模型。采用Morris水迷宮評價(jià)幼鼠學(xué)習(xí)、記憶能力,免疫組化法檢測海馬MAP-2陽性細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組逃避潛伏期時(shí)間延長,穿臺次數(shù)減少。在定位航行、空間探索能力方面頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組和針康組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在定位航行、空間探索能力方面針康組分別與頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫組化檢結(jié)果顯示:頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組、針康組海馬 CA1區(qū)MAP-2的表達(dá)均多于模型組(P＜0.05),海馬CA1區(qū) MAP-2表達(dá)針康組較頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組表達(dá)增加(P＜0.05)。結(jié)論針康法能提高HIBD幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力,其分子機(jī)制可能與海馬CA1區(qū)MAP-2陽性細(xì)胞的表達(dá)水平增加有關(guān)。

缺氧缺血性腦損傷;針康法;微管相關(guān)蛋白-2;大鼠

圍產(chǎn)期胎兒窒息引起的缺氧缺血性腦損傷最終可導(dǎo)致缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE),迄今為止尚無理想的治療方法。針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練可以提高腦癱患兒的日常生活活動(dòng)能力(activities of daily living,ADL)和爬行能力[1],減少患兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率或減輕后遺癥的嚴(yán)重程度[2]。本研究旨在通過建立缺氧缺血性腦損傷模型,探討針康法治療缺氧缺血性腦損傷的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 7日齡新生Wistar幼鼠(由長春動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),雌雄不限,體重11～15 g。隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組和針康組,每組16只。各組再按造模后14 d、28 d分為2個(gè)亞組,每組8只。

1.2 主要儀器及試劑 Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司),低氧混合氣(8%O2+92%N2)(哈爾濱卿化氣體有限公司),LEICA RM-2135輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國制造),光學(xué)顯微鏡BH-2型(日本OLYMPUS公司),華佗牌毫針(中國蘇州醫(yī)療用品廠),免疫組化試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司)。

1.3 模型的制備 乙醚麻醉狀態(tài)下,剪開皮膚及皮下組織,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈,并用0號絲線雙結(jié)扎,術(shù)后動(dòng)物回母鼠籠恢復(fù)2 h,置于37℃有機(jī)玻璃缺氧箱中,持續(xù)充以氣流量為0.5 L/min的8%氧氮混合氣體2 h。建模后出現(xiàn)夾尾左旋者納入實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)僅切開大鼠頸部皮膚并暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈,不結(jié)扎,縫合皮膚后也不予缺氧處理。結(jié)束后放回母鼠籠中喂養(yǎng)。

1.4 豐富環(huán)境(enriched environment,EE)籠和有機(jī)玻璃缺氧箱的制作

1.4.1 豐富環(huán)境籠 參照文獻(xiàn)[3]自行設(shè)計(jì),為70×60×50 cm的大籠,籠內(nèi)放置不同顏色、形狀及氣味的物體,包括各種質(zhì)感的砂紙、毛刷,冰冷的金屬和有刺激性氣味的檸檬、薄荷、棉球,還有轉(zhuǎn)盤、管道、斜坡、秋千、蹺蹺板、小球等“玩具”。

1.4.2 有機(jī)玻璃缺氧箱 自制30×30 cm上下各有1個(gè)0.5×0.5 cm小孔的容器。上孔通混合氣體,下孔與外界相通,以保持容器內(nèi)壓力與大氣一致及持續(xù)低氧狀態(tài)。箱底層有鈉石灰吸收艙內(nèi)水分和CO2。

1.5 干預(yù)方法 ①假手術(shù)組:術(shù)后將幼鼠置于普通母鼠籠中飼養(yǎng);②模型組:術(shù)后另置普通母鼠籠中飼養(yǎng),不予以任何治療;③頭穴叢刺組:術(shù)后24 h后進(jìn)行頭針治療,采用叢刺法,按照“大鼠穴位圖譜”[4]所示,取百會(huì)穴及百會(huì)左、右側(cè)各旁開2 mm處針刺,快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針2 h,每天1次;④環(huán)境刺激組:術(shù)后24 h開始給予豐富環(huán)境刺激。每天將仔鼠與母鼠分離放入豐富環(huán)境籠內(nèi)2 h。同時(shí)配明暗紅色燈光刺激及舒緩的輕音樂。干預(yù)過程中每周將環(huán)境改變兩次,以造成新異的刺激。⑤針康組:術(shù)后24 h開始予以頭穴叢刺后放入豐富環(huán)境籠中給予環(huán)境刺激2 h,之后拔針放回母鼠籠中,每天1次。

1.6 學(xué)習(xí)記憶能力評估 Morris水迷宮為一直徑150 cm、高50 cm的圓形水池,外接動(dòng)態(tài)軌跡攝像和計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)。水深30 cm,水溫保持在(24±2)℃,水中加全脂淡奶粉160 g使水渾濁。在水池邊緣確定東、南、西、北4個(gè)點(diǎn),在水池中間設(shè)立一個(gè)直徑9 cm、高29 cm的透明有機(jī)玻璃平臺,沒于水下1 cm。測試時(shí)室內(nèi)安靜,物品陳設(shè)、照明度一致。各組幼鼠在術(shù)后14 d、28 d分別進(jìn)行Morris水迷宮測試,每天上、下午各1輪,每輪4次,2次訓(xùn)練間隔30 s,每次分別從4個(gè)象限1/2弧度處頭朝壁入水,在60 s內(nèi)觸到平臺的時(shí)間為逃避潛伏期。若大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺,則以60 s計(jì)。以最后1 d 4次所用時(shí)間的總平均值作為觀察指標(biāo)。逃避潛伏期短說明實(shí)驗(yàn)成績好。共5 d。第5天下午撤除平臺,大鼠于原平臺對側(cè)象限入水,觀察其60 s內(nèi)穿越原平臺所在位置的次數(shù)(穿臺次數(shù)),測4次取其平均值。穿臺次數(shù)多說明實(shí)驗(yàn)成績好。

1.7 標(biāo)本制備 各組大鼠于術(shù)后14 d、28 d分別取出8只,在麻醉狀態(tài)下,開胸暴露心臟,先用9 g/L鹽水200 ml經(jīng)左心室快速?zèng)_洗之后,再用40 g/L多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制,pH 7.4)400 ml灌流固定。取腦后置于40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h,將固定好的腦組織用石蠟包埋,從視交叉的水平進(jìn)行冠狀切片。

將載玻片防脫片劑處理,切片脫蠟至水。蒸餾水新鮮配置3%H2O2,室溫水洗3次。過氧化氫浸泡10 min。蒸餾水洗3 min×3次。微波修復(fù)。PBS沖洗3 min×3次。滴加稀釋的一抗30 min。PBS沖洗3 min×3次。滴加稀釋的二抗30 min。PBS沖洗3 min×3次。DAB顯色,蘇木紅輕度復(fù)染。脫水、透明、封片。采用OLYMPUS光學(xué)顯微鏡觀察,每張切片不同部位400×目鏡下選3個(gè)視野,觀察陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力的評估 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各時(shí)間點(diǎn)模型組逃避潛伏期時(shí)間延長,穿臺次數(shù)減少。頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組和針康組與模型組比較,逃避潛伏期時(shí)間縮短,穿臺次數(shù)增加(P＜0.05)。針康組與頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組比較,逃避潛伏期時(shí)間縮短,穿臺次數(shù)增加(P＜0.05)。見表1和表2。P=0005;與模型組相比,c:t=2.937,P=0.015;d:t=2.820,P=0.017;e:t=2.915,P=0.013;f:t=2.813,P=0.015;與頭穴叢刺組相比,g:t=4.317,P=0.012;i:t=4.221,P=0.010;與環(huán)境刺激組相比,h:t=4.215,P=0.013;j:t=4.112,P=0.010。

表1 逃避潛伏期(s)

表2 穿臺次數(shù)

2.2 免疫組化檢測海馬CA1區(qū)微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)的表達(dá) 免疫組化檢結(jié)果顯示,各時(shí)間點(diǎn),頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組、針康組海馬CA1區(qū)MAP-2的表達(dá)均多于模型組(P＜0.05),海馬CA1區(qū)MAP-2表達(dá)針康組較頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組表達(dá)增加(P＜0.05)。

組別 n 14 d 28 d

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)目

3 討論

近年來,環(huán)境康復(fù)療法干預(yù)發(fā)育期腦損傷日益得到人們的重視。臨床研究證實(shí),早期豐富環(huán)境干預(yù)有利于腦發(fā)育和腦功能的發(fā)揮,豐富環(huán)境刺激可增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性,促進(jìn)腦發(fā)育和腦損傷的修復(fù)[5]。頭穴叢刺針法是于致順教授創(chuàng)立的治療腦性疾病的針法,具有“整體良性調(diào)整”作用,對機(jī)體可發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多水平、多途徑的調(diào)節(jié)作用[6]。

神經(jīng)細(xì)胞可塑性是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)。學(xué)習(xí)記憶功能依賴于完整的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通路,神經(jīng)突觸是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞間信息傳遞的特化結(jié)構(gòu),因而完整的突觸結(jié)構(gòu)和傳遞效能影響著復(fù)雜的學(xué)習(xí)記憶過程。大腦邊緣系統(tǒng)特別是海馬部位既是缺血缺氧的易損區(qū),又是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位,海馬CA1區(qū)損傷后必將引起腦發(fā)育過程中功能和行為的異常。

MAP-2是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白,與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)[7]。MAP-2主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞胞體、樹突、樹突棘和突觸后致密區(qū),與突觸后膜上一些信號蛋白和膜受體相連,是許多神經(jīng)信號傳導(dǎo)通路的底物,調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性以及細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、對樹突的延伸和分支起重要作用[8]。近年來MAP-2免疫活性下降在腦損傷中的作用日益受到重視[9],被認(rèn)為是腦缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞受損及再生指標(biāo)之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組海馬CA1區(qū)MAP-2表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少,免疫陽性染色產(chǎn)物呈串珠樣排列,提示缺氧缺血后神經(jīng)元受到損傷,MAP-2磷酸化障礙,微管的不穩(wěn)定性增強(qiáng),微管聚合作用下降,這樣必然會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架完整性遭到破壞、樹突崩潰,發(fā)育停止,突觸連接中斷,突觸結(jié)構(gòu)和功能受到影響。給予頭穴叢刺、豐富環(huán)境、針康法干預(yù)后,海馬CA1區(qū)MAP-2的表達(dá)均增高,提示存在神經(jīng)細(xì)胞再生、突觸重塑,表明早期干預(yù)對大鼠海馬CA1區(qū)有保護(hù)作用,可以促使樹突生長和受損細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù),增強(qiáng)神經(jīng)可塑性。提示海馬CA1區(qū)MAP-2蛋白可能參與了頭穴叢刺、環(huán)境刺激、針康法對HIBD神經(jīng)可塑性的影響。

本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),HIBD幼鼠進(jìn)行針康法干預(yù)后,水迷宮試驗(yàn)評定學(xué)習(xí)記憶能力較頭穴叢刺組、環(huán)境刺激組改善(P＜0.05)。海馬CA1區(qū) MAP-2蛋白表達(dá),針康組與頭穴叢刺、環(huán)境刺激組比較有顯著性差異(P＜0.05)。學(xué)習(xí)記憶能力改善與海馬CA1區(qū)MAP-2蛋白表達(dá)增加相一致,提示針康法促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)、記憶的改善,可能與海馬CA1區(qū)MAP-2蛋白表達(dá)增加有關(guān)。針康法有望成為臨床治療HIBD及減輕腦損傷后遺癥的經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)、無痛苦的有效方法。

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Effect of Cluster Needling of Scalp Acupuncture Combined with Rehabilitation on Learning and Memoryand Expression of Hippocampus Microtubule-associated Protein-2 in Young Ratsafter Hypoxic Ischemic Brain Damage

KONGYan,TANGQiang,ZHU Lu-wen,et al.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,Heilongjiang,China

ObjectiveTo observe the effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with rehabilitation(Tang's Approach)on learning and memory and the expression of hippocampus microtubule-associated protein-2(MAP-2)in young rats after hypoxic ischemic brain damage(HIBD).Methods80 Wistar young rats were randomly divided into 5 groups:sham group,model group,scalp cluster acupuncture group,environmental stimuli group,and acupuncture with rehabilitation group,16 rats in each group.Each group was divided into 2 subgroups on the 14th and 28th days after the model.HIBD young animal model was made by ligating left common carotid artery and inspiring 8%oxygen and 92%nitrogen mixture.Learning and memory was observed by Morris water maze,and M AP was observed by immunohistochemistry.ResultsThe results of the Morris water maze test showed that there was significant difference in ability of place navigation and space exploration in the scalp cluster acupuncture group,the environmental stimuli group,and the acupuncture with rehabilitation group compared with the model group(P＜0.05),and there was significant difference in ability of place navigation and space exploration in the acupuncture with rehabilitation group compared with the scalp cluster acupuncture group and the environmental stimuli group(P＜0.05).The results of immunohistochemistry showed that there was significant difference in the expression of M AP-2 in the scalp cluster acupuncture group,the environmental stimuli group,and the acupuncture with rehabilitation group compared with the model group(P＜0.05),and there was significant difference in the expression of MAP-2 in the acupuncture with rehabilitation group compared with the scalp cluster acupuncture group and the environmental stimuli group(P＜0.05).ConclusionLearning and memory of young rats after hypoxic ischemic brain damage can be improved by Tang's Approach which is possibly related with expression of MAP-2 in hippocampus.

hypoxic ischemic brain injury;Tang's Approach;microtubule-associated protein-2;rats

[本文著錄格式]孔妍,唐強(qiáng),朱路文,等.缺氧缺血性腦損傷后針康法對幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):310—312.

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)基金項(xiàng)目(RC2009QN004143)。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱市 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,黑龍江哈爾濱市150001。作者簡介:孔妍(1983-),女,黑龍江哈爾濱市人,2010級博士研究生,主要研究方向:小兒腦癱的康復(fù)。通訊作者:唐強(qiáng)(1963-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)方法研究。

R245,R49,R743.3

A

1006-9771(2011)04-0310-03

2011-03-16)

·專題·