王振宜，肖秀麗，唐漢鈞

復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對大鼠糖尿病創(chuàng)面中Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響

王振宜1，肖秀麗2，唐漢鈞3

目的：動(dòng)態(tài)觀察復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對大鼠糖尿病創(chuàng)面新生肉芽組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響。方法：36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為創(chuàng)面對照組、模型組、復(fù)黃膏組。采用熒光定量PCR技術(shù)，觀察不同時(shí)段創(chuàng)面新生肉芽組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果：創(chuàng)面修復(fù)第11 d，Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)復(fù)黃膏組明顯低于創(chuàng)面對照組(P<0.05)，但和模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)復(fù)黃膏組明顯高于模型組(P<0.05)，和創(chuàng)面對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏通過促進(jìn)難愈性創(chuàng)面Ⅰ、Ⅲ型膠原增殖和平衡，從而起到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。

復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏；創(chuàng)面愈合；大鼠；糖尿病

創(chuàng)面愈合是外科領(lǐng)域中一個(gè)重要問題，糖尿病、 截癱、局部射線照射等所致的創(chuàng)面愈合困難。探究創(chuàng)面修復(fù)與再生的機(jī)理,尋找有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合的治療方法,有著十分重要的意義。復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏是唐漢鈞教授根據(jù)長期治療皮膚創(chuàng)面的經(jīng)驗(yàn)所制,在臨床上取得了較好的臨床療效。為進(jìn)一步探討復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏（簡稱復(fù)黃膏）促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制,我們通過大鼠糖尿病創(chuàng)面模型外用復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏后創(chuàng)面Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA的動(dòng)態(tài)研究,探討其部分作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 清潔級Wistar大鼠，雄性，(220±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供（批號醫(yī)動(dòng)字第scxk（滬）2003－0003號）。用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為創(chuàng)面造模后換藥3 d和11 d二個(gè)觀測時(shí)段。每個(gè)時(shí)段又分為創(chuàng)面對照組、模型組和復(fù)黃膏組，每組各6只。

1.2 藥物組成及制備 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏（復(fù)黃膏）由紫草、血竭、大黃、龍骨、雞蛋黃，珍珠層粉、豬皮，麻油組成。由上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院制劑室制備成油膏（藥劑批號為040720）。正常對照組和糖尿病對照組用生理鹽水。

1.3 試劑和儀器 四氧嘧啶（Alloxan），試劑編號：2244-11-3，瑞士FULKA公司產(chǎn)品（由上海中醫(yī)藥大學(xué)藥理毒性實(shí)驗(yàn)室提供）。羅氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖儀和血糖測試試紙，編號：2005-10,22896931,瑞士Roche公司產(chǎn)品。0.1%鹽酸氯胺酮，試劑編號：KD061201，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。RT試劑盒DR019A，廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品。MARK D501A，上海寶生物工程技術(shù)公司產(chǎn)品。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TAKARA公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，美國ABI公司產(chǎn)品。全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7300），國ABI公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物創(chuàng)面造模 糖尿病大鼠模型制造參照付小兵等[1]方法改進(jìn)，隨機(jī)分為創(chuàng)面對照組、模型組和復(fù)黃膏組。禁食24 h（飲水不限），在乙醚麻醉下尾靜脈1次注射1.5%四氧嘧啶（50 mg/kg，實(shí)驗(yàn)組）及等體積生理鹽水（對照組），造模后4 h后給予5%葡萄糖水溶液飲用。次日經(jīng)尾部取血測血糖，血糖值大于10 mmol/L以上，則表明造模成功。模型制成后，每3 d測血糖1次，直到動(dòng)物處死。創(chuàng)面造模：糖尿病大鼠模型制造完成后3 d，參照付小兵等[2]方法改進(jìn)，Wistar大鼠用1%鹽酸氯胺酮（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。局部備皮，常規(guī)消毒，于Wistar大鼠背部取直徑為3 cm左右圓形切口，剪開皮膚全層，至皮下筋膜，無菌敷料加蓋，每日換藥1次。創(chuàng)面對照組造模方法同上。

1.4.2 用藥 3組大鼠于造模當(dāng)日開始換藥，換藥前用1：5 000呋喃西林清潔創(chuàng)面。創(chuàng)面對照組和模型組外敷單層生理鹽水紗布，復(fù)黃膏組外敷單層復(fù)黃膏紗布。3組大鼠傷口均外用兩層消毒干紗布覆蓋固定，每日換藥1次。

1.4.3 動(dòng)物創(chuàng)面面積測量及標(biāo)本采集 用藥后第3 d和第11 d，分別將動(dòng)物麻醉處死。測量創(chuàng)傷面積，并計(jì)算創(chuàng)面閉合指數(shù)。計(jì)算公式：創(chuàng)面閉合指數(shù)＝（1－治療后創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積）×100%[3]。用眼科手術(shù)剪分離新生創(chuàng)面肉芽組織，并成塊取下，為所需實(shí)驗(yàn)樣品。

1.4.4 Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.4.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank提供的CRD-BP mRNA序列（LOCUS ID：AF198254），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)內(nèi)、外引物及探針，引物均跨內(nèi)含子序列，保證擴(kuò)增的特異性（引物、探針由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心合成）。見表1。

表1 引物和探針序列

1.4.4.2 RT-PCR 組織RNA提取、RNA濃度測定、RNA變性凝膠電泳反應(yīng)體系為：5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μL、上游引物F 0.4 μL、下游引物R 0.4 μL、dNTPs 0.2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 1 μL、DEPC處理水10 μL、RNA模板4 μL，總體積20 μL。依次插入預(yù)先設(shè)置（37℃ 1 h、95℃ 5 min）加熱模塊。逆轉(zhuǎn)錄cDNA完成，放入－80℃冰箱備用。

1.4.4.3 FQ-PCR檢測 96孔聯(lián)體反應(yīng)板，分別加入cDNA模板。依次加入Taq酶1 μL、dNTPs 0.5 μL、上、下游引物各0.5 μL、熒光標(biāo)記探針0.5 μL、5×buffer 10 μL、ddH2O 32 μL、cDNA 5 μL，總體積50 μL。放入全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI 7300）板槽中。擴(kuò)增條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完數(shù)據(jù)保存。計(jì)算公式：mRNA相對表達(dá)量=2-△△Ct×100%，ΔCt=目標(biāo)基因CT值-內(nèi)參（GAPDH）CT值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在統(tǒng)計(jì)過程中進(jìn)行了正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)滿足方差分析條件，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面閉合指數(shù)的影響 在用藥第3 d和第11 d，模型組的創(chuàng)面閉合指數(shù)均明顯低于創(chuàng)面對照組（P<0.05）；復(fù)黃膏組的創(chuàng)面閉合指數(shù)則明顯高于模型組（P＜0.05），與創(chuàng)面對照組相當(dāng)（P>0.05）。見表2。

表2 復(fù)黃膏用藥第3 d和第11 d對大鼠糖尿病創(chuàng)面閉合指數(shù)的影響(±s，%)

表2 復(fù)黃膏用藥第3 d和第11 d對大鼠糖尿病創(chuàng)面閉合指數(shù)的影響(±s，%)

注：與創(chuàng)面對照組相比，*P<0.05,與模型組相比，▲P<0.05

組別創(chuàng)面對照組模型組復(fù)黃膏組n 創(chuàng)面閉合指數(shù)第3 d 第11 d 6 6 6 3.10±1.53 0.78±0.57*2.36±1.30▲77.55±10.00 42.39±9.78*78.01±8.85▲

2.2 對創(chuàng)面中Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響

修復(fù)第3 d，Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)3組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。創(chuàng)面修復(fù)的第11 d，Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)復(fù)黃膏組明顯低于創(chuàng)面對照組(P<0.05)，但和模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)復(fù)黃膏組明顯高于模型組(P<0.05)，和創(chuàng)面對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表3 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對大鼠糖尿病創(chuàng)面3 dⅠ型和Ⅲ型膠原mRNA水平影響(%,±s)

表3 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對大鼠糖尿病創(chuàng)面3 dⅠ型和Ⅲ型膠原mRNA水平影響(%,±s)

注：與創(chuàng)面對照組相比，*P<0.05,與模型組相比，▲P<0.05

組別創(chuàng)面對照組模型組復(fù)黃膏組n6 6 6Ⅰ型膠原2.37±2.85 1.98±1.14 1.49±1.32Ⅲ型膠原2.80±3.55 0.69±0.62 2.49±3.26

3 討論

復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏是根據(jù)糖尿病潰瘍“虛甚瘀重，瘀甚虛重”的病機(jī)立法，以祛瘀扶正,方以大黃、蛋黃油為主藥，一以活血祛瘀，一以扶正生肌；以紫草、血竭助大黃祛瘀止痛，珍珠粉等助蛋黃油生肌收口，佐以龍骨收瘡斂口，麻油生肌潤膚。全方合用，有活血祛瘀、生肌收口之功效，在臨床促進(jìn)難愈性創(chuàng)面愈合治療上取得了一定的療效[4]。本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型創(chuàng)面閉合指數(shù)結(jié)果顯示，糖尿病實(shí)驗(yàn)組結(jié)果接近正常對照組的愈合指數(shù)，而明顯優(yōu)于糖尿病對照組，同臨床治療結(jié)果相一致。

表4 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對大鼠糖尿病創(chuàng)面11 dⅠ型和Ⅲ型膠原mRNA水平影響(%，±s)

表4 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對大鼠糖尿病創(chuàng)面11 dⅠ型和Ⅲ型膠原mRNA水平影響(%，±s)

注：與創(chuàng)面對照組相比，*P<0.05，與模型組相比，▲P<0.05

組別創(chuàng)面對照組模型組復(fù)黃膏組n 6 6 6Ⅰ型膠原7.16±5.93 0.87±0.62*1.77±0.99*Ⅲ型膠原2.33±1.98 0.45±0.24 3.56±2.31▲

膠原在創(chuàng)傷修復(fù)中是構(gòu)成修復(fù)組織的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分，對于修復(fù)過程的完成有著極其重要的作用。愈合初期成纖維細(xì)胞被激活，合成和分泌膠原，膠原的產(chǎn)生既是創(chuàng)面修復(fù)的重要過程，也是瘢痕形成過程的決定性因素，故調(diào)控膠原的合成對于促進(jìn)創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成有著重要的意義。而膠原的類型很多，其中含量最豐富的是I型和Ⅲ型膠原，在創(chuàng)面愈合過程中，I、Ⅲ型膠原起著重要作用。膠原在創(chuàng)面修復(fù)過程中，作為修復(fù)質(zhì)量的終結(jié)指標(biāo)，決定著創(chuàng)面是否能順利修復(fù)，以及修復(fù)質(zhì)量高低[5]。

我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：在創(chuàng)面修復(fù)的第3 d，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)3組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但復(fù)黃膏組Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)明顯高于模型組，和創(chuàng)面對照組相當(dāng)。愈合的傷口中Ⅲ型膠原出現(xiàn)得比I型膠原早，含量增加[6]。本結(jié)果提示，在組織動(dòng)態(tài)修復(fù)過程中Ⅰ、Ⅲ型膠原在創(chuàng)面初期相互平行，應(yīng)用復(fù)黃油中藥后Ⅲ型膠原在糖尿病創(chuàng)面修復(fù)起始階段就呈現(xiàn)上升趨勢。在創(chuàng)面修復(fù)的第11 d，Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)復(fù)黃膏組明顯低于創(chuàng)面對照組(P<0.05)，但和模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，但和創(chuàng)面對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示應(yīng)用復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏具有促進(jìn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原增生作用。I型膠原纖維直徑為100～500 nm，Ⅲ型膠原直徑為40～60 nm，Ⅲ型膠原含量越高，膠原纖維越細(xì)，彈性越好，說明瘢痕的纖維化程度越低，膠原纖維就越細(xì)，形成的瘢痕就越輕，故提高Ⅲ型膠原比例是減少瘢痕的重要手段[7]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在創(chuàng)面修復(fù)后期，復(fù)黃膏可促進(jìn)Ⅲ型膠原分泌，提高Ⅲ型膠原含量，這可能是復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合減少瘢痕形成的機(jī)理之一。

復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏通過促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面Ⅰ、Ⅲ型膠原增殖和調(diào)節(jié)其平衡，從而起到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。

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Effects of Fuhuang Shengji Yuchuang(復(fù)黃生肌愈創(chuàng))Ointment on Expressions of Type I and III Colla?gens mRNA in Granulation Wound Tissue in Rats with Diabetes

Wang Zhenyi,Xiao Xiuli,Tang Hangjun.Department of Anorectal Surgery,Yueyang Hospital of ITCWM Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai（200437）,China

ObjectiveTo observe the effects of Fuhuang Shengji Yuchuang(FHSJYC)(復(fù)黃生肌愈創(chuàng))oint?ment,a compound traditional Chinese herbal medicine,on the expressions of type I and III collagens mRNA in wound granulation tissue in rats with diabetes.MethodsWistar rats were randomly divided into three groups：wound control group,normal saline(NS)group and FHSJYC group.Diabetes was induced by injection of 1.5%alloxan and oral gavage of 5%glucose,and skin wound was made in rats of the NS group and FHSJYC group.Skin wounds of the rats in the FHSJYC group were treated with FHSJYC ointment gauze dressing,while those in the NS group were treated with NS gauze dressing once daily.The rats were executed in turn on the third day and the eleventh day of the treatment,and the changes of type I and III collagen mRNA in the wound granula?tion tissue were observed by fluorescent real time quantitative polymerase chain reaction.ResultsCompared with the NS group,the wound closure index in the FHSJYC group was increased(P<0.05)After 3-day treat?ment,the expression of type I and III collagens mRNA showed no significant differences among the three groups.After 11-day treatment,the expression of type I collagen mRNAs in the FHSJYC group was lower than that in the wound control group(P<0.05),similar with those in the NS group.The expression of type III colla?gen mRNA in the FHSJYC group was higher than that in the NS group(P<0.05),similar with that in the wound control group.ConclusionFHSJYC ointment can affect the process of wound healing by promoting and regu?lating the expressions of type I and III collagens mRNA.TheseConclusionshow effects in accelerating wound heal?ing and minimizing scar proliferation in uncurable wound.

Fuhuang ShengJi Yuechuang ointment,wound healing,rats,diabetes

R587.1；Q95-33

A

1007-6948(2011)01-0063-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.023

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20050268012）

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肛腸科(上海 200437）

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院中醫(yī)外科(上海 201900）

3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科(上海 200032）

（收稿：2010-05-26 修回：2010-08-22）

（責(zé)任編輯 劉洪斌 田在善）