劉藺 王開(kāi)綠 黃玲 李文軍 鄭曉鳳 劉艷群 蒙琴

香煙提取物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá) β-防御素 2的作用研究

劉藺 王開(kāi)綠 黃玲 李文軍 鄭曉鳳 劉艷群 蒙琴

目的 探討香煙提取物(CSE)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)人β防御素2(hBD2)的影響。方法 利用不同濃度(4%和8%)的CSE刺激人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE),分別于0、6、12、24、48 h收集細(xì)胞總蛋白,運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定hBD2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 4%和8%CSE均誘導(dǎo)16HBE于6、12、24、48 h進(jìn)行性hBD2表達(dá)下降。8%CSE干預(yù)組變化幅度大于4%CSE干預(yù)組。結(jié)論CSE抑制人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)hBD2,此機(jī)制可能參與香煙對(duì)氣道防御的抑制作用。

β防御素2;香煙提取物;支氣管上皮細(xì)胞

吸煙是慢性阻塞性肺疾病(COPD)最重要的環(huán)境致病因素。研究發(fā)現(xiàn) β防御素 2(BD 2)作為一種抗微生物肽,在黏膜上皮(包括氣道上皮)炎癥-免疫防御中起重要作用[1]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔接懴銦熖崛∥?CSE)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)人β防御素2(hBD2)的直接影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)由四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸病學(xué)研究室提供,DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(高糖)購(gòu)自美國(guó)英杰(Invitrogen)生命技術(shù)有限公司;hBD 2酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)試盒購(gòu)自美國(guó)ADL公司;細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2 香煙提取物(CSE)制備 參照Taussat的方法[2]制備CSE,每只香煙(尼古丁:1mg;焦油:14mg)完全燃燒產(chǎn)生的煙霧溶于5ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中,用無(wú)菌濾過(guò)器進(jìn)行無(wú)菌化處理(0.22 um孔徑濾過(guò)膜除菌),其定為100%CSE母液,pH值調(diào)至7.4,超低溫(-80°C)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組[3]16HBE細(xì)胞按1×106個(gè)細(xì)胞接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶中,取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為①對(duì)照組:用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;②4%CSE干預(yù)組:用含4%CSE無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;③8% CSE干預(yù)組:用含8%CSE無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

蛋白提取與 hBD 2表達(dá)測(cè)定:對(duì)照組和干預(yù)組分別于 0、6、12、24、48h收集細(xì)胞總蛋白,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次?？偟鞍滋崛∨c定量均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。hBD 2蛋白表達(dá)水平按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,每個(gè)樣本均測(cè)試 2次,以2次的平均值為最終值。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)表1):相對(duì)于對(duì)照組的hBD2表達(dá)水平(基線(xiàn)水平),CSE刺激支氣管上皮細(xì)胞6 h后,hBD 2的蛋白表達(dá)在4%、8%兩個(gè)不同濃度CSE刺激組均呈時(shí)間依賴(lài)性下降,尤其8%CSE組下降更為顯著(P＜0.05)。至48 h, hBD2的蛋白表達(dá)(4%:246±28;8%:220±19 pg/mg)均顯著低于正常對(duì)照水平(P＜0.01)。

表1 不同濃度CSE對(duì)16HBE細(xì)胞表達(dá)hBD2的影響（±s,n=3,pg/mg)

表1 不同濃度CSE對(duì)16HBE細(xì)胞表達(dá)hBD2的影響（±s,n=3,pg/mg)

注:*與對(duì)照組比較P＜0.05;#與4%CSE組比較P＜0.05

組別 0 h 6 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組 341±22 342±11 340±30 335±19 323±24 4%CSE組 341±34 310±31* 291±15* 278±36* 246±28* 8%CSE組 342±16 287±44*# 263±30*# 233±24*# 220±19*#

3 討論

COPD是一種以肺部表現(xiàn)為主要特征的全身性疾病。在我國(guó),COPD具有高發(fā)病率、高致殘(死)率的特點(diǎn),嚴(yán)重危害國(guó)人的生命健康[4]。COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,多因素(包括環(huán)境因素和遺傳因素)參與其中,吸煙被認(rèn)為是COPD最重要的環(huán)境致病因素。研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧中含有超過(guò) 4000種高濃度的氧化劑。反復(fù)香煙煙霧刺激可導(dǎo)致氣道以及肺部炎癥反應(yīng)和免疫損傷,以致于更易受病原微生物的侵襲,從而導(dǎo)致氣道及肺部反復(fù)感染,并最終造成肺結(jié)構(gòu)不可逆破壞[5]。研究證明上皮細(xì)胞不僅通過(guò)物理屏障作用抵御外來(lái)病原微生物,而且還可以通過(guò)合成和分泌抗微生物肽在內(nèi)的多種細(xì)胞因子,殺滅病原微生物。在上述過(guò)程中,抗微生物多肽扮演重要的防御作用,其中防御素(尤其 BD 2)在氣道炎癥-免疫防御體系中具有重要作用,hBD2被證明廣泛表達(dá)于全身的黏膜上皮(包括氣道上皮),在黏膜的防御上起重要作用[6]。王卓等報(bào)道,與正常對(duì)照相比,穩(wěn)定期與急性加重期COPD患者誘導(dǎo)痰中 hBD 2的表達(dá)水平均有所降低,尤其在急性加重期更為明顯[7],以上研究提示COPD患者氣道防御系統(tǒng)損傷與hBD2表達(dá)下降密切相關(guān),但香煙是否直接抑制氣道上皮細(xì)胞表達(dá)hBD 2,進(jìn)而促進(jìn)香煙導(dǎo)致的氣道損傷,目前尚無(wú)明確定論。既往的研究發(fā)現(xiàn),香煙煙霧及香煙提取物可抑制人鼻竇上皮及牙齦上皮細(xì)胞表達(dá) hBD 2[8,9],李明等報(bào)道CSE可抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞(A 549)hBD2的表達(dá)[10], Herr等研究表明吸煙人群痰液中的hBD2表達(dá)水平低于不吸煙人群[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CSE刺激16HBE,hBD2的表達(dá)水平出現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性下降。該結(jié)果說(shuō)明香煙煙霧對(duì)人氣道上皮表達(dá) hBD 2的直接作用表現(xiàn)為抑制。由此可見(jiàn),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致,提示此機(jī)制在香煙對(duì)氣道防御的損傷過(guò)程中具有重要作用。但必須指出,由于COPD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,所以不可能單純從吸煙的角度去闡釋其中的全部機(jī)制,而且目前的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵膊豢赡苣MCOPD的全部特征。由此可見(jiàn),hBD 2在COPD氣道防御中的重要作用仍需要進(jìn)一步的研究闡釋。

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Effect of Cigarette Sm oke Extract onβ-defensin 2 Expression by Human Bronchial Epithelial Cell (16HBE)

LIU Lin,WANGKai-lu,HUANGLing,etal.

Departmentof RespiratoryMedicine,the Third People's Hospital of Mianyang621000,China

Objective To investigate the effectof cigarettesmoke extract(CSE)on humanβ-defensin2 (hBD2)expression by human bronchial epithelial cell(16HBE).Methods 16HBE cellswere incubated with two different concentrations of CSE(4%and 8%),and the cell protein was harvested at the experimental timepoints of0 h,6 h,12 h,24 h,48 h,respectively.ELISA was used to assess the hBD2 protein expression level. Results After CSE(4%and 8%)stimulation,the hBD2 expression level significantly decreased at6 h,12 h, 24 h,48 h timepoints time-dependently,compared with the control.The expression of hBD2 in CSE 8%group had a larger change extent than CSE 4%group.Conclusion CSE suppresses hBD2 expression by 16HBE cells,and thismechanism may contribute to the inhibition ofairway defense by cigarette smoke.

β-defensin 2;Bronchialepithelial cell;Cigarette smoke extract

621000綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院呼吸科

劉藺 Email:liulin528@126.com