王 壯 ，劉 富 ，紀(jì) 慧 ，田 華

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院成人及繼續(xù)教育學(xué)院學(xué)工辦，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院辦公室，黑龍江齊齊哈爾 161006；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

近年來，研究細(xì)胞膜離子通道活動(dòng)的主要方法是膜片鉗技術(shù)，而獲得活力好的神經(jīng)元便成為應(yīng)用膜片鉗技術(shù)的重要先決條件。許多離子通道研究是需要單個(gè)分散的神經(jīng)元，人工培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞易受培養(yǎng)環(huán)境的影響，自身特性改變較大，而急性分離的細(xì)胞卻能相對保持完好的生理特性[1-3]。筆者結(jié)合文獻(xiàn)并加以改進(jìn)，摸索出一種簡便易行的適用于全細(xì)胞膜片鉗研究的大鼠頂葉皮層神經(jīng)元急性分離方法，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，10～16 d，雌雄不限，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院動(dòng)物研究中心提供。

1.2 試劑

胰蛋白酶(Protease)、四乙胺(TEA)、4-氨基 吡啶(4-AP)、EGTA、HEPES、CsCl，均為 Sigma 公司產(chǎn)品，其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 大鼠皮層神經(jīng)元的急性分離

斷頭取大腦皮層，切成厚約0.4 mm的冠狀腦片，置于通有95%O2和5%CO2混合氣體的人工腦脊液[ACSF（mmol/L）：NaCl 142， KCl 5， CaCl22， MgSO42， D-Glucose 10， HEPES 10，pH 7.3，32℃]中孵育1 h后，再在通有95%O2和5%CO2混合氣體的0.1%胰蛋白酶（用ACSF配制）溶液中消化30 min。消化好的腦片以ACSF沖洗、剪碎，以尖端拋光的Pasteur吸管（口徑分別為 500、300、150 μm）依次吹打，使組織塊分散，吹打成細(xì)胞懸液，靜置2～4 min后，吸取上清液，滴于有飽和氧細(xì)胞外液（mmol/L，NaCl 130、KCl 5.4、CaCl21、MgCl21、Glucose 25、HEPES 10、CdCl20.2，pH7.3） 的培養(yǎng)皿中， 靜置20 min細(xì)胞貼壁后進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在20～25℃下進(jìn)行。

1.4 全細(xì)胞記錄方

對神經(jīng)元電生理的膜片鉗研究，要求細(xì)胞的膜光滑完整、清潔、狀態(tài)良好，破膜后對其細(xì)胞活性仍能保持很長一段時(shí)間[4]。選取狀態(tài)良好的神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。電極內(nèi)預(yù)先灌注電極內(nèi)液，通過三維微操縱儀使電極進(jìn)入細(xì)胞外液，顯示器上可見封接測試脈沖，其大小代表電極電流，并可顯示據(jù)此計(jì)算出的電極電阻，通常為2～4 MΩ。當(dāng)電極尖與細(xì)胞表面接觸時(shí)，由于電極電阻的突然增加，電極電流會(huì)減小，細(xì)胞膜出現(xiàn)顫動(dòng)，給予電極以一定的負(fù)壓，顯示器上的測試脈沖逐漸減小，成為直線，并出現(xiàn)大小相同、方向相反的電容瞬流，其由電極夾持器和電極管壁形成。此時(shí)電阻顯示＞1 GΩ，表明形成高阻封接。調(diào)節(jié)放大器上的快電容補(bǔ)償旋鈕以抵消此電容電流。然后給予快速負(fù)壓或向細(xì)胞膜施加以一短脈沖使電極吸附處的細(xì)胞膜破裂，電極液與細(xì)胞液相通從而形成全細(xì)胞記錄。此時(shí)出現(xiàn)來自細(xì)胞膜較大的跨膜電流瞬流，調(diào)節(jié)放大器上的慢電容補(bǔ)償旋鈕和串聯(lián)電阻補(bǔ)償旋鈕以抵消電容電流和串聯(lián)電阻造成的電壓降。即可在電壓鉗模式下，進(jìn)行電流的觀察和記錄。數(shù)據(jù)分析用Clampfit 8.2軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 急性分離的大鼠皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下，分離完整的神經(jīng)元表面光潔，有較強(qiáng)的光暈，而且有較長的突起。細(xì)胞胞體呈現(xiàn)錐形、橢圓形或三角形，胞質(zhì)均勻，折光性好；一般有1個(gè)頂樹突和2個(gè)或多個(gè)基數(shù)突。完整的神經(jīng)細(xì)胞在人工腦脊液中可維持其形狀6 h以上（圖 1）。

2.2 離子通道研究

用錐體細(xì)胞作為研究對象，利用前述標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液，采樣參數(shù)文件保持電位-80 mV，從-40 mV去極化到+60 mV，共10個(gè)階躍，每個(gè)階躍增加10 mV去極化，脈沖寬度為100～300 ms，刺激頻率為1 Hz。全細(xì)胞電壓鉗制條件下記錄出的原始電流如圖2A，可見電流分內(nèi)向電流和外向電流，內(nèi)向電流可被1 μmol/L河豚毒阻斷，用CsCl代替電極內(nèi)液的KCl，則外向電流被1 mmol/L 4-AP和10 mmol/L TEA大部分阻斷，向該細(xì)胞附近添加TTX和4-AP后，可以記錄到延遲整流鉀電流IK（圖2B）。在細(xì)胞外液中添加TTX和TEA后，可以記錄到瞬間外向鉀電流IA（圖2C）。

3 討論

3.1 動(dòng)物的選擇

理論上鼠齡越小的大鼠皮層神經(jīng)元耐受缺氧能力越強(qiáng)，活性越好，分離的效果也越好。鼠齡過大神經(jīng)元突起較多較長，分離時(shí)容易損傷，分離出來的細(xì)胞易于封接但破膜比較困難；鼠齡過小神經(jīng)元未分化成熟，記錄出的通道電流較小，且在破膜時(shí)負(fù)壓稍大即可將細(xì)胞吸入電極內(nèi)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)，選擇鼠齡在10～16 d的幼鼠為宜，最佳時(shí)間為13 d。

3.2 大鼠皮層神經(jīng)元的急性分離

膜片鉗記錄成功的關(guān)鍵是分離完整的、表面光潔的、存活時(shí)間較長的錐體細(xì)胞。急性分離過程中需要注意的主要關(guān)鍵問題如下：①電極內(nèi)預(yù)先灌注電極內(nèi)液，為防止電極尖的阻塞，可對電極液進(jìn)行濾膜過濾。電極內(nèi)可以給予正壓以防止電極尖吸附灰塵和顆粒。②孵育及標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液pH值，酶濃度及作用時(shí)間是影響細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)鍵應(yīng)嚴(yán)格控制。③腦片制備：取材時(shí)不要擠壓腦組織，以免造成損傷。動(dòng)作要迅速，腦片制備必須在通氧的冰ACSF中進(jìn)行，腦片對缺氧敏感，在孵育及酶處理過程中必須連續(xù)供給氧氣。通氣時(shí)注意防止腦片隨氣泡翻動(dòng)。④消化酶隨用隨配，防止酶活力下降[5-7]。酶解過程中的酶量與酶解時(shí)間要嚴(yán)格控制，酶量增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞消化過度，膜片鉗記錄時(shí)間縮短；酶量不足導(dǎo)致細(xì)胞消化不夠，不易破膜，難以形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式。⑤腦片薄厚切得要適中，過厚不利于氧氣透過造成細(xì)胞缺氧，過薄則機(jī)械性損傷較大。⑥腦片吹打[8]：選擇口徑大小合適的吹打管，從粗到細(xì)依次吹打腦片（口徑分別為 500、300、150 μm），效果較好。吸管直徑過大或過小，均會(huì)造成損傷，不能得到狀態(tài)良好的神經(jīng)元。此外，吹打腦片動(dòng)作要輕柔，否則加重細(xì)胞損傷。

本實(shí)驗(yàn)分離的大鼠皮層細(xì)胞具有明顯的突起，細(xì)胞膜表面光潔、光暈好。用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在急性分離的細(xì)胞上記錄到上述全細(xì)胞鈉、鉀電流，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用該方法急性分離皮層神經(jīng)元，可用于膜片鉗技術(shù)探究大腦皮層離子通道及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為深入了解大腦皮層的功能及其相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制和藥物治療研究奠定基礎(chǔ)。

[1]韓濟(jì)生.神經(jīng)科學(xué)原理 [M].2版.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社,1999：1084-1103.

[2]高秀萍,張宇.大鼠海馬神經(jīng)元急性分離法[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(3)：197-198.

[3]楊雷,李玉榮,蘇莉芬,等.大鼠皮層神經(jīng)元急性分離改良方法[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,39(3)：285-287.

[4]鄒飛,高天明,陳培熹.適用于膜片鉗研究的成年大鼠腦神經(jīng)元急性分離法[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,1995,11(1)：27-81.

[5]李剛,程立君,林凌,等.小鼠海馬神經(jīng)元急性分離和膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用[J].天津大學(xué)學(xué)報(bào),2008,41(10)：1157-1160.

[6]笱玉蘭,羅利俊,陳國華,等.改良的適用于膜片鉗研究的大鼠海馬神經(jīng)元急性分離法[J].中國康復(fù),2010,25(6)：416-418.

[7]李從德,陸永利,楊紅衛(wèi),等.以膜片鉗技術(shù)急性分離新生大鼠尾核神經(jīng)元[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(37)：7322-7325.

[8]馮冠青,趙世剛,楊雷,等.大鼠海馬錐體神經(jīng)元的急性分離方法[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志,2009,41(8)：912-914.