李曉燕， 許紅輝， 韓桂茹， 李向軍， 冷仲秋

(1.河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北石家莊050035;2.河北省藥品檢驗(yàn)所，河北石家莊050011;3.河北承德隆化衛(wèi)校，河北承德068150)

丹皮酚為中藥牡丹皮中的主要活性成分，具有抗心律失常，抗動脈粥樣硬化，抗高血壓及抗菌、抗變態(tài)反應(yīng)和增強(qiáng)免疫的藥理作用【1】。牡丹皮為一種常用中藥材，配伍在多種成方制劑中，僅《中國藥典》2005年版一部收載的成方制劑中含牡丹皮的品種就有35種。丹皮酚的含量測定方法主要為高效液相色譜法【2】，其次是薄層掃描法【3】，掃描法多在(274±1)nm處進(jìn)行掃描測定，供試品溶液的濃度相對較高(0.5 mg/mL)，線性范圍在1～5 μg，對丹皮酚含量低微的樣品，掃描法根本無法檢出。遇到高效液相法丹皮酚波峰有干擾的情況下，定量測定就更難以進(jìn)行。為開發(fā)丹皮酚不同形式的、高靈敏度測定方法，對丹皮酚進(jìn)行增熒光后，熒光薄層掃描定量測定研究，獲得理想的測定結(jié)果，大幅度提高了丹皮酚的檢測靈敏度以及方法的重現(xiàn)性和精密度。從測定的簡便性、快捷性、靈敏性與測定成本等多因素綜合比較，丹皮酚的激發(fā)熒光掃描法有優(yōu)于高效液相法的趨勢，為丹皮酚的高靈敏度測定提供了新途徑。報道如下:

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料 牡丹皮藥材由安國以嶺中藥飲片有限公司提供;清胃黃連蜜丸(批號:071149)由內(nèi)蒙古伊泰丹龍藥業(yè)提供;清胃黃連水丸(批號:20080201)由山西旺龍藥業(yè)提供:養(yǎng)陰清肺丸(批號:9013041)由北京同仁堂制藥廠提供;丹皮酚對照品(批號110708-200505)購自中國藥品生物制品檢定所。微量定量點(diǎn)樣毛細(xì)管(美國)。

1.2 儀器 CS-9301PC薄層色譜掃描儀(日本島津)。

1.3 試劑 硅膠G(青島海洋化工廠，批號:060214)。其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 取丹皮酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末或蜜丸碎粒適量(約相當(dāng)牡丹皮藥材0.15 g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱定重量，如為蜜丸浸泡10 h以上，用玻棒研磨使樣品溶散，用數(shù)滴甲醇沖洗玻棒于錐形瓶中，超聲處理(功率300 W，頻率50 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足或揮散至原重量，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 薄層色譜掃描條件 熒光法單波長線性掃描;激發(fā)波長292 nm，1號濾光片，線性化參數(shù)SX=3;線性回歸二點(diǎn)法計算含量。

2.4 測定波長及濾光片的選擇 精密吸取上述供試品溶液與對照品溶液，交叉點(diǎn)于同一薄層板上，展開，晾干，增熒光，在不同的濾光片下，逐波長進(jìn)行激發(fā)，記錄熒光強(qiáng)度的積分值(見表1)，并以波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度積分值為縱坐標(biāo)，分別繪制熒光強(qiáng)度積分曲線，得1號、2號濾光片二條曲線(見圖1、2)。3號濾光片下強(qiáng)度積分值太小，4號濾光片下無強(qiáng)度積分值。從圖1、2數(shù)值可見，1號與2號濾光片熒光強(qiáng)度稍有區(qū)別，但最大吸收均在292 nm，1號濾光片下熒光強(qiáng)度較2號濾光片熒光強(qiáng)約1 000，因此選擇1號濾光片，激發(fā)波長定為292 nm。

圖1 1號濾光片激發(fā)掃描圖

2.5 薄層定量測定 精密吸取供試品溶液2～4 μL、對照品溶液2 μL與6 μL，分別交叉點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(8:2:1:0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液進(jìn)行增熒光反應(yīng)，置紫外光燈(365 nm)下定位。采用激發(fā)波長λ=292 nm，進(jìn)行熒光掃描，用線性回歸二點(diǎn)法計算含量。樣品和牡丹皮藥材的測定結(jié)果見表2:

表1 丹皮酚在不同濾光片下熒光強(qiáng)度積分值

圖2 2號濾光片激發(fā)掃描圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在同一塊薄層板上，分別點(diǎn)2、3、5、6、7、9 μL丹皮酚對照品溶液(20.1 μg/mL)，按樣品測定項(xiàng)下的條件展開，晾干，增熒光后，進(jìn)行熒光掃描測定。以濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度的積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:對照品的點(diǎn)樣量在0.040 2～0.180 9 μg范圍內(nèi)，與熒光強(qiáng)度的積分值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=27.89X+982.79，r=0.999 7。

表2 樣品與牡丹皮藥材含量測定結(jié)果

2.7 同板精密度試驗(yàn) 在同一塊板上交叉點(diǎn)丹皮酚對照品與樣品溶液各5個點(diǎn)，展開，晾干，增熒光后，掃描測定。對照品的RSD為1.59%，樣品的RSD為0.81%。

2.8 異板精密度試驗(yàn) 在不同的薄層板上，交叉點(diǎn)丹皮酚對照品與供試品溶液，展開，晾干，增熒光后，掃描測定，并計算含量，樣品的平均含量為25.68 mg/g，RSD為1.31%。

2.9 儀器精密度試驗(yàn) 在薄層板上交叉點(diǎn)對照品溶液與供試品溶液各3 μL，展開，晾干，增熒光后，對照品與供試品的斑點(diǎn)各連續(xù)掃描5次，記錄熒光強(qiáng)度積分值，結(jié)果表明:對照品的RSD為0.59%，樣品的RSD為0.09%，表明儀器性能良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取丹皮酚對照品溶液與樣品溶液各3 μL，交叉點(diǎn)于同一塊薄層板上，展開，增熒光，每相隔一定時間，掃描測定一次，結(jié)果表明:熒光斑點(diǎn)穩(wěn)定，在考察的1.5 h內(nèi)，對照品的RSD為2.39%，樣品的RSD為2.68%。

2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品9份，分別取高(0.18 g)、中(0.15 g)、低(0.12 g)3個劑量，按供試品溶液的制備方法制備，展開，增熒光后，掃描測定。樣品中丹皮酚的平均含量為25.62 mg/g，RSD%為1.83%。表明方法重復(fù)性良好。

2.12 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收實(shí)驗(yàn)。取同一批樣品9份，分為3組，按高、中、低3個劑量，分別加入25 mL不同濃度的丹皮酚對照品甲醇溶液，進(jìn)行超聲提取，展開、熒光掃描測定，計算回收率。丹皮酚的平均回收率為101.80%，RSD為1.58%(n=9);測定結(jié)果見表3。

表3 丹皮酚含量回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.13 專屬性實(shí)驗(yàn) 取空白(不含牡丹皮的樣品)樣品，按樣品測定項(xiàng)下，提取，展開，增熒光，置紫外光燈(UV365 nm)下檢視，在丹皮酚相應(yīng)的位置上，無相同的熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)，空白不干擾測定。色譜掃描，空白為一平滑的直線，無熒光吸收(見圖3)，定量測定專屬。

圖3 丹皮酚定量測定TLC色譜圖

2.14 最低檢出限與最低定量限 對丹皮酚的最低檢出限和最低定量限進(jìn)行了考察，即取每1 mL含1 μg的丹皮酚對照品溶液，分別點(diǎn)2、3、4…13 μL，12 個點(diǎn)，展開，增熒光后，檢測，4 μL的斑點(diǎn)即呈現(xiàn)明顯的熒光斑點(diǎn)，其最低檢出限為0.004 μg;再取每1 mL含10 μg的丹皮酚對照品溶液，分別點(diǎn) 1、2、3…5 μL，5 個點(diǎn)，展開，增熒光后，掃描測定，結(jié)果顯示，點(diǎn)樣量在0.03 μg熒光強(qiáng)度積分值在2 000左右，大小適宜，穩(wěn)定，確定為最低定量限(見圖4)。

3 討論

圖4 最低定量限圖

3.1 丹皮酚是一種不呈現(xiàn)熒光的化合物，點(diǎn)于GF254薄層板，展開后，在紫外光燈(254nm)下濃度高時呈現(xiàn)出棕褐色斑點(diǎn)，濃度低時，無任何檢測信息，無法檢測或進(jìn)行高靈敏度的掃描定量。與增熒光劑三氯化鋁反應(yīng)后，可呈現(xiàn)很強(qiáng)的亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，定性檢出限度為0.004 μg，定量檢出限為0.03 μg。通過丹皮酚無熒光到有熒光的質(zhì)變，大幅度提高了丹皮酚的檢測靈敏度，達(dá)紫外掃描法［3］的25倍以上，可與高效液相法相提并論，使樣品中的微量丹皮酚有了簡便、快捷的定性與定量新方法。其相當(dāng)于每g成方制劑中只要含0.08 mg或3 mg牡丹皮藥材即可進(jìn)行定性檢出和定量測定。這種高靈敏度的定性檢出目前還無簡便、快捷的其他方法能夠取代(見圖5)。

圖5 各樣品丹皮酚圖譜

上述照片圖1～3為清胃黃連丸中丹皮酚薄層圖譜，是同一塊薄層板。4～6為養(yǎng)陰清肺丸中丹皮酚薄層圖譜，是同一塊薄層板。其中1.3.5.7.9.11為樣品，2.4.6.8.10為丹皮酚對照品。從照片可以看到兩種樣品，在未增熒光之前，不論是254 nm，還是365 nm下檢視，在樣品與丹皮酚對照品相應(yīng)位置都無任何信息斑點(diǎn)，無法檢出，但增熒光后，樣品和對照品都出現(xiàn)了非常清晰的亮蘭色熒光斑點(diǎn)，可用于丹皮酚簡便、快捷的微量定性鑒別和定量測定。

3.2 目前為止，本作者已對數(shù)種無熒光化合物進(jìn)行了增熒光研究，除了上述的丹皮酚增熒光定量測定外，還嘗試了甾體化合物膽酸與硫酸乙醇液顯色增熒光，選擇激發(fā)波長(385±1)nm的定量測定［4］，使膽酸的檢測靈敏度提高了10倍，干擾物質(zhì)降低到1/10。增熒光的研究思路為同行提供了無熒光化合物的定性與定量測定新途徑(見人工牛黃的薄層鑒別圖6)。

3張照片是同一薄層板，為牛黃消炎片中人工牛黃TLC圖，其中1.3.5樣品，2.4.6膽酸。從照片可以看到在未增熒光之前，不論是254 nm，還是365 nm下檢視，在樣品與膽酸對照品相應(yīng)位置都無任何信息斑點(diǎn)，無法檢出，增熒光后，樣品和對照品都出現(xiàn)了非常強(qiáng)的清晰亮蘭色熒光斑點(diǎn)，而用于貴重藥材人工牛黃的微量或痕量檢出。對中成藥中微量成分的質(zhì)量監(jiān)督，具有重要意義。

圖6 人工牛黃的薄層鑒別

［1］郭 齊，李貽奎，王治國，等.丹皮酚藥理研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息雜志，2009，26(1):20-22.

［2］中國藥典［S］.一部.2005:119.

［3］劉義梅.薄層掃描法測定知柏地黃丸中丹皮酚含量［J］.湖北中醫(yī)雜志，2005，27(7):52-53.

［4］李向軍，韓桂茹，吳 廣，等.熒光掃描法測定復(fù)方氨酚烷胺片中膽酸的含量［J］. 中國藥業(yè)，2009，18(17):17-18.