陳 麗， 程屹俊， 梁瓊麟， 王義明， 由春娜， 董 敏， 羅國(guó)安，3*

(江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，江西南昌 330004;2.清華大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究中心，北京 100084;3.華東理工大學(xué)中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237;4.北京北大維信生物科技有限公司，北京 100080;5.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺(tái) 264003)

希明婷片是由升麻總皂苷經(jīng)輔料加工而成，主要用于女 性圍絕經(jīng)期綜合征，改善烘熱汗出，煩躁易怒等癥狀［1-2］。文獻(xiàn)報(bào)道升麻中三萜皂苷具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的作用［3］，Erdal Bedir和Ikhlas A.Khan從升麻中分離出27-脫氧升麻亭［4］。故本實(shí)驗(yàn)選擇以三萜皂苷中的27-脫氧升麻亭為指標(biāo)成分控制希明婷片的質(zhì)量。

目前，紫外檢測(cè)器(UVD)、示差折光檢測(cè)器(RID)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)、質(zhì)譜檢測(cè)器(MSD)是檢測(cè)中藥成分質(zhì)量常用的4種檢測(cè)器，其中紫外檢測(cè)器只能用于有紫外吸收的物質(zhì)的分析，其余3種檢測(cè)器均為通用型檢測(cè)器，可用于未知物、糖類、脂肪烴、其他無(wú)紫外吸收物質(zhì)等的分析。3種通用型檢測(cè)器中，RID和ELSD與MSD相比，因價(jià)格更便宜，應(yīng)用相對(duì)更廣。27-脫氧升麻亭為無(wú)紫外吸收物質(zhì)，可采用常用的通用型檢測(cè)器(RID、ELSD、MSD)進(jìn)行檢測(cè)，因MSD昂貴，不宜采用。文獻(xiàn)［5］中有報(bào)道采用示差折光檢測(cè)器測(cè)定升麻藥材中27-脫氧升麻亭的質(zhì)量，但未曾見采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立了采用HPLC-ELSD法測(cè)定希明婷片中27-脫氧升麻亭的含量的方法，并比較了ELSD和RID兩種檢測(cè)器對(duì)測(cè)定27-脫氧升麻亭的影響。

1 材料和試藥

0.45 μm微孔濾膜;資生堂 MG C18柱;乙腈(色譜純，fisher公司)，超純水(Milli Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)制，過(guò)0.2 μm微孔濾膜)。無(wú)水甲醇(分析純，北京化工廠生產(chǎn));27-脫氧升麻亭標(biāo)準(zhǔn)品(山東綠葉制藥有限公司提供);希明婷片(山東綠葉制藥有限公司，批號(hào):20070329、20071143、20081234、20090742)。

BS110S電子天平(d=0.1 mg，賽多利斯公司);XP205型電子天平(d=0.01 mg，梅特勒托利多公司);Agilent 1200系列高效液相色譜儀(配備Alltech N2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站);KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率 40 KHz);MilliQSynthesis超純水純化系統(tǒng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 資生堂MG C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:水-乙腈梯度洗脫(見表1)，流速:1 mL/min，柱溫:30℃，氣體(氮?dú)?流速:2.9 L/min，漂移管溫度:115℃。對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL。理論塔板數(shù)以27-脫氧升麻亭峰計(jì)不低于5 000。結(jié)果見圖1～2。

表1 梯度條件

2.2 希明婷片供試品溶液的制備 取10片希明婷片，研細(xì)后，取200 mg希明婷片粉末，精密稱定。置25 mL量瓶中，量取20 mL甲醇，超聲溶解30 min后，甲醇定容至刻度。過(guò)0.45 μm微孔濾膜，所得濾液即為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 稱取對(duì)照品27-脫氧升麻亭6.70 mg，甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，得對(duì)照品溶液。

圖1 27-脫氧升麻亭的HPLC-ELSD圖譜

圖2 希明婷片的HPLC-ELSD圖譜

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取1.5、1.25、0.75、0.45、0.25 mL的對(duì)照品溶液至2 mL量瓶中，甲醇稀釋定容，即得6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰面積值的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=1.445 4X+4.961，r2=0.999 7，其線性范圍為1.67 ～13.40 μg。

2.5 最低檢測(cè)限及定量限試驗(yàn) 采用信噪比法檢測(cè)27-脫氧升麻亭的檢出限及定量限。以信噪比為3:1時(shí)相應(yīng)濃度確定其檢測(cè)限，以信噪比大于或等于10:1且能準(zhǔn)確定量時(shí)的相應(yīng)濃度確定其定量限。

將27-脫氧升麻亭對(duì)照品溶液稀釋一定倍數(shù)，進(jìn)樣20 μL，得到27-脫氧升麻亭的檢出限及定量限，檢測(cè)限為:0.100 μg，定量限為:0.904 μg。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取1個(gè)27-脫氧升麻亭對(duì)照品溶液分別連續(xù)進(jìn)樣6次及6日內(nèi)每日進(jìn)樣一次，分別計(jì)算6次所測(cè)的組分峰面積及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)，日內(nèi)精密度的RSD為4.18%，日間精密度的RSD為4.71%。結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、3、6、20、22、24 h不同時(shí)間間隔點(diǎn)進(jìn)樣分析，對(duì)峰面積進(jìn)行考察，峰面積的RSD為3.43%。結(jié)果顯示樣品溶液至少在24 h穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批希明婷片(批號(hào)20090742，每片的平均重量為101.93 mg)，按供試品溶液制備方法制備6份，每份樣品進(jìn)樣2針，每針進(jìn)樣量20 μL。以分別計(jì)算27-脫氧升麻亭的含量(外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)方程計(jì)算)及RSD(%)，結(jié)果其平均含量為2.61%，RSD為4.94%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批希明婷片(批號(hào):20090742)，按2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法，平行制備9份樣品，每 3份樣品分別加入高(120%)、中(100%)、低(80%)3個(gè)不同每個(gè)樣品按照2.1項(xiàng)色譜條件，分別測(cè)定其色譜圖，計(jì)算其27-脫氧升麻亭的加樣回收率，結(jié)果表明平均加樣回收率為102.20%，RSD為2.68%(n=9)，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好(見表2)。

表2 27-脫氧升麻亭的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定 取3批希明婷片，按2.2項(xiàng)供試品溶液制備方法制備。按2.1項(xiàng)下的色譜條件分析對(duì)照品溶液和供試品溶液，每批希明婷片重復(fù)測(cè)定3次，按外標(biāo)法計(jì)算各樣品中27-脫氧升麻亭的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 供試品溶液的制備 采用不同濃度的甲醇溶解升麻總皂苷提取物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，升麻總皂苷提取物在甲醇中溶解最好。此外，采用甲醇超聲溶解希明婷片粉末10 min、20 min、30 min、45 min，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲溶解30 min后，升麻總皂苷即提取完全。

3.2 檢測(cè)器的選擇 本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了RID和ELSD在相同色譜條件下(等度洗脫:乙腈-水=40:60)分析樣品時(shí)所得色譜圖，見圖3和圖4。結(jié)果顯示，ELSD所得圖譜基線更穩(wěn)定、噪音干擾更小;而且，ELSD的檢測(cè)沒(méi)有流動(dòng)相的限制且可以梯度洗脫，因而本實(shí)驗(yàn)采用ELSD作為27-脫氧升麻亭含量測(cè)定的檢測(cè)器。

3.3 洗脫梯度及色譜柱的選擇 采用不同等度洗脫和梯度洗脫條件分析樣品時(shí)，等度洗脫雖然分析時(shí)間短，但27-脫氧升麻亭和相鄰峰的分離情況對(duì)色譜柱的耐用性差，故最終確定表1中所列洗脫梯度為最終洗脫梯度。在該洗脫梯度下，27脫氧升麻亭的峰形和分離度都較好，且采用Agilent C18柱、Phenomenex C18柱、Agela C18柱等色譜柱在相同色譜條件下分析樣品時(shí)27-脫氧升麻亭均獲得較好的分離。且樣品溶液中其它色譜峰的峰形和分離度也較好，為希明婷片其它成分的定量提供參考方法。

圖3 等度洗脫下HPLC-RID的色譜圖(1為27-脫氧升麻亭)

圖4 等度洗脫下HPLC-ELSD的色譜圖(1為27-脫氧升麻亭)

從研究分析結(jié)果顯示，通過(guò)該方法不僅可對(duì)希明婷片中的活性成分的含量進(jìn)行控制，同時(shí)也為測(cè)定希明婷片中其它成分的含量，提高希明婷片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

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