夏君慧， 翁益云， 李 佳， 張 旭

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江溫州325000)

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)為少突膠質(zhì)細(xì)胞膜結(jié)合糖蛋白，是中樞神經(jīng)髓鞘的重要組成部分，研究顯示抗MOG抗體在多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)的病理過程中起著非常重要的作用，由MOG誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前國(guó)際上公認(rèn)的MS動(dòng)物模型［1］。目前國(guó)內(nèi)所使用的MOG多為人工合成的MOG肽段。MOG細(xì)胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域(extracellular immunoglobulin domain of MOG，MOGIgd)含有多個(gè)抗原表位，具有很強(qiáng)的免疫原性［2－5］，此研究旨在將編碼 MOG1－100(包括 MOGIgd)的基因克隆到硫氧還蛋白(thioredoxin，TrxA)融合表達(dá)載體pET32a(+)中，在BL21(DE3)trxB－宿主菌中得到目的蛋白表達(dá)，并探討表達(dá)產(chǎn)物MOGIgd－TrxA融合蛋白能否作為免疫原誘導(dǎo)EAE動(dòng)物。

材料和方法

1 材料

1.1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α華山醫(yī)院神經(jīng)病研究所樊永峰博士惠贈(zèng);表達(dá)載體pET32a(+)(Novagen產(chǎn)品)由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物室孫興會(huì)博士惠贈(zèng);宿主菌BL21(DE3)trxB－(Novagen產(chǎn)品)為復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院葛曉春老師惠贈(zèng)。

1.2 引物 上游引物 P1:5'－GCAGAATTCGGGCAGTTCAGAGTGATAGGA－3’，含EcoRI酶切位點(diǎn);下游引物P2:5'－ ACATCTCGAGTCGGAAGAAGCAGGTGAAAC － 3’，含XhoI酶切位點(diǎn)。由上海生工合成。

1.3 主要試劑及設(shè)備 Trizol試劑盒、RT－PCR試劑盒(TaKaRa);Xho I、EcoRI限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒及DNA純化試劑盒(上海博彩生物有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)用胰化蛋白胨及酵母提取物(Gibco－BRL);異丙基－β－D－硫代半乳糖苷(isopropyl－β－D－thiogalactopyranoside，IPTG)及咪唑(上海普飛生物技術(shù)有限公司);Ni－NAT His.Bind Resins(Novagen產(chǎn)品);丙烯酰胺、N，N＇－ 亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、過硫酸胺及 N，N，N＇，N＇－ 四甲基乙二胺(tetramethyl ethylene diamine，TEMED)(Sigma)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie，EDTA);羊毛脂、液體石蠟、結(jié)核桿菌(H37Rv)及百日咳毒素(pertussis toxin，PT，Sigma)。高速勻漿機(jī)(上海標(biāo)本模具廠)，臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)(Beckman)，空氣浴振蕩器(哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠)，垂直電泳儀(Bio－Rad)。

1.4 動(dòng)物 體重18－20 g、8－10周齡雌性 C57BL/6小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司);體重180－200 g白色豚鼠(溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不拘。

2 方法

2.1 表達(dá)載體pET32a－MOGIgd的構(gòu)建和鑒定 RT－PCR、酶切、連接及轉(zhuǎn)化采用常規(guī)方法;采用試劑盒抽提質(zhì)粒。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Eco RI及Xho I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行初步鑒定，再送上海申能博彩生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2.2 MOGIgd－TrxA融合蛋白與TrxA蛋白的表達(dá)及鑒定將篩選所得的重組質(zhì)粒pET32a－MOGIgd及pET32a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21－trxB－，分別涂LB/(50 mg/L氨芐青霉素、15 mg/L卡那霉素)瓊脂板上，37℃培養(yǎng)12－16 h。挑陽(yáng)性菌落分別接種3 mL雙抗生素培養(yǎng)液試管中，培養(yǎng)過夜。各取1 mL菌液加入100 mL的雙抗生素培養(yǎng)液中，37℃、250 r/min振蕩至A600≈0.8，加入1 mol/L IPTG于30℃、250 r/min振蕩5 h，收集菌體。部分菌體予滲透休克處理，離心后取上清及沉淀;部分菌體經(jīng)超聲粉碎、裂解液處理，離心后取上清及沉淀。行SDS－PAGE以確定是否有目的蛋白表達(dá)，目的蛋白以可溶性形式表達(dá)或以包涵體形式表達(dá)。

2.3 MOGIgd－TrxA融合蛋白與TrxA蛋白純化 擴(kuò)大體積誘導(dǎo)BL21－trxB－/pET32a－ MOGIgd菌及 BL21－trxB－/pET32a(+)菌表達(dá)。上一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)MOGIgd－TrxA融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，故通過分離包涵體粗提MOGIgd－TrxA融合蛋白，BL21－trxB－/pET32a－MOGIgd發(fā)酵液離心后棄上清，沉淀用 TE緩沖液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)懸浮，超聲粉碎菌體15 s×6次，每次間隔20 s，裂解菌液離心后棄上清，沉淀即包涵體用0.9%生理鹽水洗滌1次。包涵體經(jīng)金屬螯合親和層析柱進(jìn)一步純化，上述包涵體加入結(jié)合緩沖液(8 mol/L urea;0.1 mol/L NaH2PO4;0.01 mol/L Tris－HCl，pH 8.0)打勻，離心留上清;取 Ni－ NAT His.Bind Resins，注入層析柱，結(jié)合緩沖液平衡后自然沉淀，接核酸蛋白檢測(cè)儀，取波長(zhǎng)280 nm;加樣，反復(fù)打勻后自然沉淀，打開下閥門，出現(xiàn)第1峰直至恢復(fù)至基線，洗滌緩沖液(8 mol/L urea;0.1 mol/L NaH2PO4;0.01 mol/L Tris － HCl，pH 6.3)沖洗，洗脫液(8 mol/L urea;0.1 mol/L NaH2PO4;0.01 mol/L Tris－HCl，pH 4.5)洗脫，收集流出峰。TrxA蛋白以可溶性形式表達(dá)，通過滲透休克粗提TrxA蛋白，加入結(jié)合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0;0.3 mol/L NaCl;10 mmol/L 咪唑，pH 8.0)上層析柱，洗滌緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0;0.3 mol/L NaCl;20 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗滌，洗脫液(50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0;0.3 mol/L NaCl;250 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脫，收集流出峰。

2.4 抗原制備及模型制作 將獲得的MOGIgd－TrxA融合蛋白、TrxA蛋白和生理鹽水分別與完全福氏佐劑(complete Freund＇s adjuvant，CFA)等體積混勻，制成油包水型乳劑。C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，MOGIgd－TrxA組(MOG組)、硫氧還蛋白組(TrxA組)及正常對(duì)照組(NC組)，12只/組，以相應(yīng)抗原乳劑免疫小鼠制作EAE模型，采用Kono標(biāo)準(zhǔn)5分法［6］對(duì)小鼠進(jìn)行臨床功能評(píng)分。詳細(xì)過程見李佳等［7］所述。

2.5 病理學(xué)觀察 高峰期處死小鼠，取出腦、脊髓組織后制作石蠟切片，厚度為6 μm，同一部位同時(shí)切取2張切片，分別行蘇木素－伊紅(hematoxylin－eosin，HE)染色及髓鞘Luxol fast blue染色。

結(jié) 果

1 MOGIgd蛋白cDNA克隆、融合表達(dá)及純化

1.1 表達(dá)載體 pET32a－MOGIgd的構(gòu)建及鑒定 人腦總RNA進(jìn)行RT－PCR，將322 bp目的基因片段回收后，利用引物上所帶Xho I和EcoR I酶切位點(diǎn)將基因片段切出連入載體pET32a(+)中。雙酶切后顯示1條303 bp片段，見圖1。進(jìn)一步送上海博彩生物有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示與編碼MOG1－100的堿基序列完全一致，表明MOGIgdcDNA已正確克隆到pET32a(+)載體中。

Figure 1.Restriction analysis of pET32a － MOGIgd.1:DNA marker;2:MOGIgdcDNA;3:pET32a－MOGIgd;4:pET32a－MOGIgddigested with XhoⅠand EcoR Ⅰ圖1 pET32a－MOGIgd的酶切鑒定

1.2 MOGIgd－TrxA融合蛋白與TrxA蛋白的表達(dá)及鑒定攜有重組表達(dá)載體pET32a－MOGIgd和pET32a(+)的大腸桿菌BL21－trxB－經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5 h后，菌體裂解物進(jìn)行SDSPAGE分析。結(jié)果顯示MOGIgd－TrxA融合蛋白位于約32 kD處，經(jīng)灰度掃描分析顯示表達(dá)量占菌體總蛋白的42%左右，并以包涵體形式存在;而無(wú)插入的pET32a(+)表達(dá)約21 kD的單體蛋白TrxA，經(jīng)滲透休克釋放于上清液中，見圖2。

Figure 2.Expression of MOGIgd－TrxA fusion protein and TrxA protein in BL21(DE)trxB－.1:protein marker;2，3:pET32a－MOGIgdbacteria before induction and after 5－ hour induction，respectively;4，5:supernatant and pellet fractions from induced pET－MOGIgdbacteria after sonication，respectively;6，7:pET － 32a(+)bacteria before induction and after 5－h(huán)our induction，respectively;8，9:supernatant and sediment from induced pET －32a(+)bacteria after osmotic shock，respectively.圖2 MOGIgd－TrxA融合蛋白和TrxA單體蛋白在BL21(DE)trxB－菌中的表達(dá)

1.3 MOGIgd－TrxA融合蛋白與TrxA蛋白純化 經(jīng)金屬螯合親和層析純化后MOGIgd－TrxA與TrxA蛋白的純度達(dá)95%左右，見圖3。

Figure 3.Purification of MOGIgd－TrxA fusion protein and TrxA protein.1:protein marker;2:pET32a－MOGIgdinclusion body;3:flow through;4:purified MOGIgd－TrxA;5:supernatant of induced pET32a(+)bacteria after osmotic shock;6:flow through;7:purified TrxA protein.圖3 MOGIgd－TrxA融合蛋白與TrxA蛋白純化

2 MOGIgd－TrxA融合蛋白誘導(dǎo)EAE模型

2.1 臨床癥狀及神經(jīng)功能評(píng)分 發(fā)病小鼠多表現(xiàn)為尾部張力下降，后肢麻痹，弓背，全身震顫，體重下降(部分小鼠體重下降不明顯)。MOG組小鼠發(fā)病率為75%(9/12)，于免疫后第(12.14±2.04)d發(fā)病，癥狀達(dá)峰時(shí)間為發(fā)病后(4.43±1.13)d，高峰期神經(jīng)功能評(píng)分為(2.64±0.48)，隨著觀察期的延長(zhǎng)，小鼠的病程呈慢性非緩解型，癥狀稍有波動(dòng)。TrxA組和NC組小鼠無(wú)發(fā)病。

2.2 病理檢測(cè) HE染色發(fā)現(xiàn)，MOG組存在炎癥浸潤(rùn)，炎癥病灶主要累及脊髓實(shí)質(zhì)、灰白質(zhì)交界處、側(cè)腦室周圍及大腦皮髓質(zhì)交界處以至深部白質(zhì)等部位，受累部位表現(xiàn)為以單核細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。髓鞘Luxol fast blue染色可見白質(zhì)疏松，顏色淡染，局部斑片狀髓鞘脫失，主要累及側(cè)腦室旁、腦干、小腦等部位，見圖4。TrxA組和正常對(duì)照組均無(wú)上述表現(xiàn)。

Figure 4.Confluent demyelination near the lateral ventricle of MOG group(Luxol fast blue staining，×400).圖4 MOG組側(cè)腦室旁脫髓鞘病灶

討 論

MS是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，臨床表現(xiàn)為慢性復(fù)發(fā)性或慢性進(jìn)展性病程，病理表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及髓鞘脫失。EAE是MS的經(jīng)典動(dòng)物模型，MOG主動(dòng)免疫可誘導(dǎo)出慢性復(fù)發(fā)性EAE，伴有廣泛的髓鞘脫失，與MS非常相似［1］。MOG最先由Linington等［8］于1984年用小鼠單抗8－18C5發(fā)現(xiàn)并命名，為特異性表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的膜結(jié)合蛋白，位于髓鞘結(jié)構(gòu)的最外層。成熟的MOG由218個(gè)氨基酸組成，其胞外段含1個(gè)免疫球蛋白樣可變結(jié)構(gòu)域，具有多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，有很強(qiáng)的免疫原性。MOG具有高度疏水性，且含量極微，僅占人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘蛋白的0.05%－0.10%，所以從組織中純化到足夠量的MOG極為困難。目前主要通過人工合成的方法獲得MOG肽段，運(yùn)用最多的為MOG35－55，但合成肽段技術(shù)要求高，價(jià)格昂貴。本研究用分子克隆技術(shù)將MOG胞外段包括MOGIgd在內(nèi)的第1－100位氨基酸的cDNA克隆到表達(dá)載體pET32a(+)中，在BL21(DE3)trxB－宿主菌中實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)，表達(dá)量占總菌體蛋白的42%左右。此法具有產(chǎn)量高、純化方便的優(yōu)勢(shì)。

國(guó)外學(xué)者曾以多種原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)MOG的胞外段，產(chǎn)物均形成包涵體［9，10］。我們所要表達(dá)的 MOGIgd預(yù)測(cè)分子量?jī)H11 kD左右，等電點(diǎn)為9.14，含有1個(gè)二硫鍵。選擇TrxA作為融合表達(dá)系統(tǒng)，是由于TrxA參與細(xì)胞內(nèi)一些蛋白質(zhì)的二硫鍵形成，可以幫助蛋白質(zhì)正常折疊，從而產(chǎn)生有活性的可溶蛋白質(zhì)，同時(shí)避免細(xì)胞膜內(nèi)蛋白酶的降解。另外，多種TrxA融合蛋白質(zhì)可以通過滲透休克從大腸桿菌中定量地釋放出來，可用作初步純化融合蛋白的有效手段［11］。pET32a(+)表達(dá)載體運(yùn)用了經(jīng)過改造的BL21(DE3)trxB－宿主菌，該菌內(nèi)的TrxA還原酶被突變，更有利于二硫鍵的形成。令人遺憾的是，雖然采用改變溫度、細(xì)胞密度及誘導(dǎo)劑的濃度等措施，但最終MOGIgd－TrxA融合蛋白仍以包涵體的形式表達(dá)，這可能與MOGIgd本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。本研究通過超聲破菌等處理獲得包涵體，對(duì)MOGIgd－TrxA融合蛋白進(jìn)行初步純化。由于pET32a(+)載體在TrxA與目的蛋白之間插入組氨酸標(biāo)簽，此標(biāo)簽可與金屬離子螯合，通過金屬螯合親和層析柱進(jìn)一步純化，獲得純度為95%左右的目的蛋白。

我們?cè)毛@得的MOGIgd－TrxA融合蛋白為包被抗原，成功檢測(cè)MS患者血清和腦脊液中抗MOG抗體，證實(shí)其具有抗原性［12］。本研究證實(shí)MOGIgd－TrxA融合蛋白具有免疫原性，將其主動(dòng)免疫C57BL/6小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物EAE的成模率為75%，呈慢性非緩解病程，病灶多發(fā)，累及脊髓、大腦半球、小腦及腦干，病理表現(xiàn)為以單核細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及髓鞘脫失。TrxA組小鼠不管臨床還是病理上均無(wú)類似表現(xiàn)，證明TrxA無(wú)免疫原性。

綜上所述，本研究成功建立人MOGIgd的TrxA融合表達(dá)系統(tǒng)，通過較為簡(jiǎn)便的方法獲得高產(chǎn)量、高純度的MOGIgd－TrxA融合蛋白，MOGIgd融合蛋白具有免疫原性，可作為免疫原誘導(dǎo)EAE動(dòng)物模型。

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