張 妍， 崔保霞， 馬道新， 劉 藝， 田永菊， 侯 菲， 張文靜

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院1 婦產(chǎn)科，3 血液病研究中心，山東 濟(jì)南250012;2 濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濰坊262500;4 山東省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，山東 濟(jì)南250117)

宮頸癌是僅次于乳癌的第二位常見(jiàn)婦女惡性腫瘤，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是其根本病因［1，2］。但是，HPV 感染后，絕大多數(shù)患者的免疫系統(tǒng)可將病毒清除，只有很少一部分持續(xù)感染者的宮頸損害會(huì)經(jīng)由宮頸上皮內(nèi)瘤Ⅰ級(jí)(cervical intraepithelial neoplasia I，CIN I)發(fā)展為CIN III 進(jìn)一步進(jìn)展為侵潤(rùn)癌［3］。這就意味著免疫調(diào)節(jié)在HPV 介導(dǎo)的致癌作用中起著很重要的作用。

Th17 細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+效應(yīng)性T 細(xì)胞，以其特異性的分泌IL－17 而命名。Th17 細(xì)胞介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與自身免疫性疾病、移植物抗宿主等疾病的發(fā)生和發(fā)展，決定疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，備受免疫學(xué)界的關(guān)注［4，5］。而其在腫瘤免疫應(yīng)答中的表達(dá)及作用的報(bào)道卻很少且存在爭(zhēng)議。有研究表明，前列腺癌和卵巢癌患者外周血Th17 細(xì)胞比例升高，但卻得出了升高的Th17 細(xì)胞既促進(jìn)腫瘤進(jìn)展又抑制腫瘤進(jìn)展的結(jié)論［6，7］。而另一研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者與正常人的外周血Th17 細(xì)胞比例無(wú)明顯差異，但腫瘤組織中分離出的侵潤(rùn)性T 細(xì)胞里Th17 比例卻顯著上升［8］。關(guān)于Th17 細(xì)胞在宮頸癌中的研究還未見(jiàn)報(bào)道。IL－21 是Th17 細(xì)胞高表達(dá)的一個(gè)細(xì)胞因子，是IL－2 家族的新成員，Th17 通過(guò)自分泌IL－21 的途徑調(diào)節(jié)自身的分化和功能［9］。作為Th17細(xì)胞的功能性細(xì)胞因子，IL－21 還可以放大和維持Th17 細(xì)胞的功能［10］，而IL－17 則不能［4］。為了探討Th17 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們檢測(cè)了宮頸癌患者、CIN 患者以及正常對(duì)照外周血中Th17 細(xì)胞和CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討它們之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑及儀器 藻紅蛋白－ 花青染料5(phycoerythrin－cyanine 5，PE－Cy5)標(biāo)記的抗人CD3 單抗、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗人CD8 單抗、PE 標(biāo)記的抗人白細(xì)胞介素－17(interleukin－17，IL－17)單抗和PE標(biāo)記的抗人IL－21 單抗均購(gòu)自eBioscience;佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin)和莫能霉素(monensin)均購(gòu)自Alexis Biochemicals。采用BD Bioscience PharMingenCalibur 流式細(xì)胞儀測(cè)定淋巴細(xì)胞各種熒光素的熒光強(qiáng)度。

1.2 研究對(duì)象 2009 年12 月至2010 年6 月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收治的宮頸癌患者37 例，年齡34－70歲，平均45 歲;CIN 患者25 例，年齡28－60 歲，平均42 歲，均經(jīng)宮頸活檢或手術(shù)病理證實(shí)。對(duì)照組18例，全部為健康志愿者，年齡26－67 歲，平均42 歲，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查陰性。3 組中年齡無(wú)顯著差異。合并糖尿病、高血壓、心血管疾病、妊娠、急慢性感染、結(jié)締組織病或既往有腫瘤病史者排除入選。分期執(zhí)行國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2000 年)分期標(biāo)準(zhǔn)。入選患者的基本臨床特征見(jiàn)表1 及表2。所有入選患者均為初治，未經(jīng)手術(shù)、化療及放射等任何治療。

表1 宮頸癌患者的臨床特征Table 1. Clinical characteristics of cervical cancer patients(n =37)

表2 CIN 患者的臨床特征Table 2. Clinical characteristics of CIN patients(n=25)

本研究獲得山東大學(xué)齊魯醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均知情并簽署知情同意書，然后采集晨起空腹肝素鈉抗凝靜脈血4 mL。

2 方法

2.1 Th17 細(xì)胞及CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞的檢測(cè)

IL－17 和IL－21 都是胞內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞因子，通過(guò)流式技術(shù)檢測(cè)其含量來(lái)反映Th17 和CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞的水平。取肝素鈉抗凝的全血200 μL，加入同體積的不含牛血清的RPMI－1640，再加入PMA (工作濃度25 μg/L)、ionomycin (工作濃度1 mg/L)和monensin (工作濃度1.7 mg/L)，混勻后在37 ℃、5% CO2孵箱中孵育4 h?；靹蚝蠓謩e取100 μL 于3 個(gè)流式管中，標(biāo)記為Th17 細(xì)胞管、CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞管和同型對(duì)照管。按說(shuō)明書要求加入PE－Cy5 抗人CD3 單抗和FITC 抗人CD8 單抗，室溫下避光孵育15 min，以標(biāo)記CD4+T 細(xì)胞(CD3+CD8－T 細(xì)胞)。用生理鹽水洗滌，固定、破膜后，分別加入說(shuō)明書推薦劑量的PE 標(biāo)記抗人IL－17單抗、抗人IL－21 單抗和同型抗體，室溫下避光孵育15 min。生理鹽水洗滌后，PBS 重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，3 組間比較采用方差分析，2 組間的比較用t 檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 Th17 細(xì)胞在CIN 及宮頸癌患者外周血中的比例升高

Figure 1. The levels of circulatory Th17 cells and CD3 +CD8 －IL－21 +T cells in representative cervical cancer (CC)patients，cervical intraepithelial neoplasia (CIN)patients and controls. A:lymphocytes were gated by flow cytometry.B:CD3 + T subsets were gated by flow cytometry. Plots in the internal box represented CD3 + T cells. C，D，E:the proportions of Th17 to CD3 +subsets from representative controls，CIN patients and CC patients，respectively.F，G，H:representative IL－21 expression in CD3 + subsets from controls，CIN patients and CC patients were shown，respectively. The percentages of positive cells were shown in each panel.圖1 Th17 細(xì)胞和CD3 +CD8 －IL－21 +T 細(xì)胞在宮頸癌、CIN 及正常對(duì)照組中的表達(dá)

Figure 2. The proportions of CD3 + CD8 － IL－21 + T cells and Th17 cells detected by flow cytometry. ± s. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs cervical cancer;△P ＜0.05，△△P＜0.01 vs CIN.圖2 CD3 +CD8 －IL－21 +T 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞在宮頸癌、CIN和正常人中的比例

在PMA/ionomycin 短時(shí)間孵育后，Th17 細(xì)胞和CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞在宮頸癌患者、CIN 患者及正常對(duì)照者外周血中的比例變化見(jiàn)圖1、2。與正常人［(1.30±0.51)%］相比，Th17 細(xì)胞比例在宮頸癌患者［(2.30 ±0.78)%，P ＜0.01］和CIN 患者［(2.05 ±0.82)%，P ＜0.01］明顯升高。CIN 患者與宮頸癌患者Th17 細(xì)胞的比較無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。宮頸癌患者Th17 細(xì)胞比例增高的程度與臨床分期呈正相關(guān)(P ＜0.05)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵潤(rùn)相關(guān)，其比例在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組［(2.97 ±0.51)% vs (2.01±0.85)%，P ＜0.01］和有脈管浸潤(rùn)組［(3.20 ±0.45)% vs (1.74 ±0.67)%，P ＜0.01］明顯升高，見(jiàn)圖3。Th17 細(xì)胞比例與腫瘤的大小、組織學(xué)類型、分化程度及浸潤(rùn)深度無(wú)顯著相關(guān)性(P ＞0.05)。

Figure 3. The proportion of Th17 cells and its correlation with lymph node metastasis or vasoinvasion in cervical cancer patients. ±s. ＊＊P ＜0.01 vs positive.圖3 宮頸癌患者Th17 細(xì)胞比例與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Figure 4. The correlation between CD3 +CD8 －IL－21 +T cell proportion and lymph node metastasis，vasoinvasion(A)or tumor size(B)in cervical cancer patients. ±s. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs positive;△P ＜0.05 vs ≥4 cm.圖4 宮頸癌患者CD3 +CD8 －IL－21 +T 細(xì)胞比例與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管轉(zhuǎn)移及腫瘤大小的關(guān)系

2 CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞在CIN 及宮頸癌患者外周血中的比例升高

與正常對(duì)照組［(4.54 ±2.22)%］相比，CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞比例在CIN 患者組［(5.22 ±1.74)%，P ＜0.05］及宮頸癌患者組［(6.17 ±2.21)%，P ＜0.05］都明顯升高，而CIN 組與宮頸癌組之間無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。在宮頸癌組，CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞比例亦與臨床分期呈正相關(guān)(P＜0.05)，并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組［(7.29 ±2.43)% vs (5.66 ±2.24)%，P ＜0.05］，脈管侵潤(rùn)組高于無(wú)脈管侵潤(rùn)組［(7.86 ±1.43)% vs(4.63 ±1.88)%，P ＜0.01］。CD3+CD8－IL－21+T細(xì)胞比例還與腫瘤大小相關(guān)，與腫瘤體積＜4 cm 組［(5.21 ±2.43)%］相比，腫瘤體積≥4 cm 組［(7.08±2.31)%，P ＜0.05］其比例明顯升高。CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞比例與組織學(xué)類型、分化程度及浸潤(rùn)深度無(wú)明顯相關(guān)(P ＞0.05)。

3 Th17 與CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞的相關(guān)性

如圖5 所示Th17 細(xì)胞比例與CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞比例在正常對(duì)照組(r =0.753，P ＜0.01)和宮頸癌組(r =0.760，P ＜0.01)呈顯著正相關(guān)，而在CIN 患者組則無(wú)相關(guān)性(r=0.410，P ＞0.05)。

Figure 5. The correlation between Th17 cells and CD3 +CD8 －IL－21 +T cells. Positive correlation between the percentages of Th17 and CD3 +CD8 －IL－21 +T cells were found in healthy controls (A:r=0.753，P ＜0.01)and cervical cancer patients (B:r=0.760，P ＜0.01). No significant correlation was found in CIN (cervical intraepithelial neoplasia)patients (r=0.410，P ＞0.05). Pearson correlation test was used.圖5 Th17 細(xì)胞與CD3 +CD8 －IL－21 +T 細(xì)胞的相關(guān)性分析

討 論

Th17 細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有了重新的認(rèn)識(shí)［11，12］。在分化與調(diào)節(jié)上，Th17 細(xì)胞與具有顯著免疫抑制效應(yīng)的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)反向調(diào)節(jié)，關(guān)系密切［4，13］。在功能上，Th17 細(xì)胞及其細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在感染、炎癥、自身免疫性疾病及移植物抗宿主病中發(fā)揮著重要作用。而炎癥與腫瘤之間具有緊密的聯(lián)系［14］。因此Th17 細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系已成為目前腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)。

最近研究發(fā)現(xiàn)Th17 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子可能與腫瘤相關(guān)，并參與介導(dǎo)炎癥相關(guān)性腫瘤的免疫發(fā)病機(jī)制。但對(duì)Th17 細(xì)胞在腫瘤免疫中的性質(zhì)、作用和調(diào)控機(jī)制仍不完全清楚［4，15］。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞在胃癌患者的外周血、引流淋巴結(jié)中的比例升高，并且升高的程度與臨床分期有關(guān)，認(rèn)為Th17 可能促進(jìn)了胃癌的病理發(fā)展［16］。Kryczek 等［7］也報(bào)道Th17 細(xì)胞比例在前列腺癌小鼠、上皮性卵巢癌患者的外周血中升高。我們的研究結(jié)果也顯示，與健康對(duì)照組相比，Th17 細(xì)胞比例在CIN 和宮頸癌患者的外周血中升高，差異顯著。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，外周血中的Th17 細(xì)胞可能是腫瘤侵潤(rùn)Th17 細(xì)胞的主要來(lái)源［17］，而腫瘤內(nèi)的Th17 細(xì)胞中超過(guò)95%者不表達(dá)CD62L 和CCR7(稱之為effector memory T Tem，不能進(jìn)入二級(jí)淋巴組織)，表示這些細(xì)胞是組織的常駐細(xì)胞，不會(huì)進(jìn)入淋巴管和外周血循環(huán)［18］。Bonnotte等［19］通過(guò)結(jié)腸腺癌大鼠模型發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤部位CCL20(CCR6 的受體，可誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞遷徙［17，20］)表達(dá)上調(diào)，并對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。這些數(shù)據(jù)表明，外周的Th17 細(xì)胞或許是腫瘤浸潤(rùn)Th17 細(xì)胞的重要來(lái)源，并與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。我們的結(jié)果顯示，宮頸癌患者組的Th17 細(xì)胞比例隨著臨床分期的進(jìn)展而逐步升高，而且與沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組或沒(méi)有脈管轉(zhuǎn)移組相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和脈管轉(zhuǎn)移組的Th17 細(xì)胞比例都分別增高，差異顯著。由于臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管轉(zhuǎn)移狀況是評(píng)價(jià)宮頸癌預(yù)后的最重要指標(biāo)，這一結(jié)果就暗示著Th17 細(xì)胞在宮頸癌的進(jìn)展和導(dǎo)致不良預(yù)后上扮演著促進(jìn)的角色。類似的結(jié)果在胃癌的研究中也得以發(fā)現(xiàn)［16］。我們會(huì)進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，以驗(yàn)證這一結(jié)論。

Th17 的一個(gè)重要的效應(yīng)性細(xì)胞因子是IL－21。IL－21 是Th17 細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子之一，不但以自分泌的形式通過(guò)STAT3 途徑誘導(dǎo)Th0 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞分化［9，21］，還能刺激CD4+Th0 細(xì)胞分泌IL－17［10］。由于IL－21 的最主要來(lái)源是Th17 細(xì)胞［4，20，22］，并且具有放大和維持Th17 細(xì)胞功能的作用［10］，因此我們同樣通過(guò)流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)了CD3+CD8－IL－21+T 淋巴細(xì)胞在宮頸癌、CIN 和正常人外周血中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞比例在CIN 患者和宮頸癌患者中升高，并隨著疾病的進(jìn)展逐步升高，增高的程度與宮頸癌的臨床分期呈正相關(guān)。同樣類似于Th17細(xì)胞的是，CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞比例在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，在脈管侵潤(rùn)組中高于無(wú)脈管侵潤(rùn)組，差異顯著。同時(shí)我們的結(jié)果也顯示Th17 細(xì)胞比例與CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞比例呈正相關(guān)，這些數(shù)據(jù)從側(cè)面進(jìn)一步支持了Th17 細(xì)胞在宮頸癌患者升高的結(jié)果。此外，研究發(fā)現(xiàn)IL－21還能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌MIP－3α(macrophage inflammatory protein，CCL20)［23］，并 在其 趨 化 因 子 受 體CCR6 的吸引下誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞進(jìn)行遷徙［17，20］。因此我們推測(cè)CD3+CD8－IL－21+T 細(xì)胞在Th17 細(xì)胞促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起了重要的輔助調(diào)節(jié)作用。但在生理狀態(tài)下，荷瘤機(jī)體自分泌IL－21 的能力或許受到了Th17 細(xì)胞的限制，分泌的IL－21 只能在局部起作用，并不能達(dá)到高水平以發(fā)揮抗腫瘤作用，因此，如何協(xié)調(diào)Th17 細(xì)胞與IL－21 的關(guān)系或許可以成為腫瘤治療的可行性策略。

綜上所述，IL－21 伴隨著Th17 細(xì)胞在CIN 和宮頸癌患者體內(nèi)表達(dá)增高，并隨著疾病進(jìn)展逐步積聚，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。盡管IL－21具有抗腫瘤作用，但是由于其來(lái)源主要是Th17 細(xì)胞，并在Th17 細(xì)胞的分化和功能維持上起著重要作用，因此，重新認(rèn)識(shí)兩者之間的關(guān)系和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，并加以合理利用，將會(huì)為宮頸癌的臨床治療開(kāi)辟一條新的策略。

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