何 麗， 梅 麗， 馬經(jīng)平， 張惠蘭△， 張 波， 熊維寧， 趙建平

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，衛(wèi)生部重點(diǎn)呼吸病研究室，湖北武漢430030;2荊州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北荊州434020)

氣道上皮是肺組織接觸外界環(huán)境有害物刺激的第一道屏障，氣道上皮細(xì)胞缺陷在肺部疾病中的作用越來越為人們所重視［1］。而多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究及基因組學(xué)分析表明小鼠鈣激活氯通道 3(mouse calcium－activated chloride channel 3，mCLCA3)基因是一種哮喘相關(guān)基因，其在哮喘小鼠的氣道上皮特異性表達(dá)，可能參與調(diào)節(jié)哮喘氣道黏液分泌和固有免疫［2］;此外mCLCA3也被認(rèn)為參與囊性肺纖維化的黏液分泌［3］。本課題組的前期研究也表明mCLCA3與氣道上皮表達(dá)的多種炎性因子具有相關(guān)性［4］。為了進(jìn)一步研究mCLCA3在肺部疾病氣道上皮缺陷中的作用，本部分研究我們利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了肺表面活性蛋白A(pulmonary surfactant－associated protein A，SPA)基因啟動(dòng)子啟動(dòng)mCLCA3表達(dá)的氣道上皮細(xì)胞靶向表達(dá)腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pDC315－SPA－mCLCA3，并分別轉(zhuǎn)染(高表達(dá)SPA蛋白)氣道上皮細(xì)胞系H441細(xì)胞和非氣道上皮細(xì)胞系HEK293細(xì)胞，以驗(yàn)證其在氣道上皮細(xì)胞的靶向表達(dá)功能。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α(Tiangen)質(zhì)粒 pGL－SPA:本課題組前期構(gòu)建［5］;質(zhì)粒 pCR －Blunt II－TOPO(含有mCLCA3全長基因片段，基因號(hào);NM_017474.2，Thermo);質(zhì)粒 pDC315－SPA－mCLCA3、pDC315－EGFP(吉?jiǎng)P生物構(gòu)建);人Clara氣道上皮細(xì)胞系NCI－H441及人胚腎細(xì)胞株HEK293(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 主要試劑 RPMI－1640培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco)，無內(nèi)毒素中量質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，合成引物與測序(上海生工)，Trizol(Invitrogen)，mRNA Selective PCR Ver.1.1(TaKaRa)，SP －9000 免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉)。

2 方法

2.1 pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 (1)以載體PGL－SPA為模板，Primer(+)SPA －Xba I－F(TTATTATAGTCAGCTCTAGATCGAGGTTTCTAAGTGTTCTTC)和Primer(－)SPA －R(GATTCCATAAGCTTGAGTGGACAAGTGG)進(jìn)行PCR克隆197 bp的SPA片段;(2)以pCR－Blunt II－TOPO載體為模板，Primer(+)CLCA3－F(CCACTCAAGCTTATGGAATCTTTGAAGAGTCCTG)和Primer(－)CLCA3－ EcoR I－R(CCCTTGCTCACCATGAATTCGTGCAAACCTAGTGTCACCT)進(jìn)行PCR克隆2 771 bp的mCLCA3片段;(3)以SPA和mCLCA3片段為模板，Primer(+)SPA －Xba I－F和Primer(－)CLCA3－EcoR I－R進(jìn)行PCR克隆2 948 bp的SPA－mCLCA3片段;(4)Xba I和EcoR I酶切pDC315－EGFP載體得到538 bp和4 080 bp兩段線性化片段，SPA－mCLCA3 PCR產(chǎn)物交換連接入4 080 bp的線性化表達(dá)載體得到pDC315－SPA－mCLCA3(圖1);(5)按照分子克隆技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化、鋪板、挑選陽性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序鑒定。

Figure 1.Constructive route of pDC315－SPA －mCLCA3 plasmid with SPA promoter and mCLCA3 gene.圖1 pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒的構(gòu)建路線圖

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 按照美國菌種保藏中心及本實(shí)驗(yàn)室常用方法培養(yǎng)H441和HEK293細(xì)胞，H441以含2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L的丙酮酸鈉、10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液;HEK293細(xì)胞采用含10%DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率分析 按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書操作進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分別于pDC315－SPA－mCLCA3和pDC315－EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h、36 h、48 h時(shí)在熒光顯微鏡下觀察H441和HEK293各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(視野中陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例)并拍照。

2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞mCLCA3轉(zhuǎn)錄水平檢測 利用Trizol試劑，按操作說明，分別從轉(zhuǎn)染pDC315－SPA－mCLCA3和pDC315－EGFP質(zhì)粒48 h時(shí)的細(xì)胞株H441和HEK293中提取總RNA，并按照 mRNA Selective PCR Ver.1.1試劑盒說明書和mCLCA3基因的上、下游引物(上游引物 5'－CACAACCACTAAGGTGGCCT－3';下游引物5'－AGGTGTTGAAGTGGTCCCTG－3')完成RT－PCR反應(yīng)。

2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞mCLCA3蛋白檢測 采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法分別檢測pDC315－SPA－mCLCA3和pDC315－EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h的H441和HEK293細(xì)胞，細(xì)胞爬片用乙醇固定10 min，PBS沖洗3遍后固定于載玻片上，按照SABC免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，mCLCA3抗體滴度為1∶500，陰性對(duì)照用PBS代替Ⅰ抗。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 質(zhì)粒鑒定

正、反向測序結(jié)果比對(duì)后表明亞克隆片段與目標(biāo)序列的理論序列完全一致，質(zhì)粒構(gòu)建正確，見圖2。

2 H441和HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微鏡下觀察pDC315－EGFP和pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2種細(xì)胞后24、36、48 h熒光表達(dá)發(fā)現(xiàn):pDC315－EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組3個(gè)時(shí)點(diǎn)在2種細(xì)胞中均有綠色熒光，且3個(gè)時(shí)點(diǎn)熒光表達(dá)無明顯差異;pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組3個(gè)時(shí)點(diǎn)在2種細(xì)胞中均無綠色熒光;其中pDC315－EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H441和HEK293細(xì)胞36 h時(shí)的轉(zhuǎn)染效率分別為 29.4% ±8.3%和83.2% ±6.3%，表明pDC315－EGFP質(zhì)粒在2種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 HEK293＞H441，由于質(zhì)粒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率主要取決于細(xì)胞種類和轉(zhuǎn)染試劑，因此pDC315－EGFP質(zhì)粒在2種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率間接反應(yīng)了pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒在2種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，見圖3。

3 mCLCA3 mRNA在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后H441和HEK293細(xì)胞中的表達(dá)差異

H441和HEK293細(xì)胞pDC315－EGFP轉(zhuǎn)染組均無mCLCA3 mRNA表達(dá)，而pDC315－SPA－mCLCA3組有不同程度mCLCA3 mRNA表達(dá)，且其在H441細(xì)胞表達(dá)顯著高于HEK293細(xì)胞，差異均顯著(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 2.Sequencing spectrum of pDC315－SPA －mCLCA3 pasmids containing SPA promoter and mCLCA3 gene.These were the first and the fifth steps of all five sequencing reaction steps.圖2 pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒部分測序圖譜

Figure 4.Comparison of mCLCA3 mRNA levels in H441 and HEK293 cells transfected with pDC315－SPA－mCLCA3(HpDC and 2pDC)or pDC315－EGFP(HC and 2C).M:marker;HC and HpDC:H441 cells transfected with pDC315－EGFP and pDC315－SPA－ mCLCA3 plasmids，respectively;2C and 2pDC:HEK293 cells transfected with pDC315－EGFP and pDC315 －SPA － mCLCA3 plasmids，respectively.The mRNA expression levels were very low and hardly detected in H441 and HEK293 cells transfected with pDC315－EGFP plasmids.±sE.n=3.#P＜0.05 vs HEK293 cells transfected with pDC315－SPA－mCLCA3 plasmids.圖4 pDC315－EGFP和pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H441和HEK293細(xì)胞后mCLCA3 mRNA的表達(dá)

4 mCLCA3蛋白在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后H441和HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H441細(xì)胞胞漿呈黃棕色，而pDC315－EGFP對(duì)照質(zhì)粒組H441細(xì)胞胞漿無明顯黃棕色出現(xiàn)，表明pDC315－SPA－mCLCA3轉(zhuǎn)染H441細(xì)胞后能夠表達(dá)mCLCA3蛋白;pDC315－SPA－mCLCA3轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后未見mCLCA3陽性表達(dá)，說明pDC315－SPA－mCLCA3在氣道上皮細(xì)胞表達(dá)的特異性，見圖5。

討 論

本研究中我們得出以下結(jié)論:(1)RT－PCR結(jié)果顯示pDC315－EGFP(GFP陽性對(duì)照質(zhì)粒，mCLCA3陰性對(duì)照質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染 H441和 HEK293后均無 mCLCA3的表達(dá)，而pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后2種細(xì)胞均有表達(dá)，且mCLCA3 mRNA在H441的表達(dá)顯著高于其在HEK293細(xì)胞的表達(dá)(P＜0.05);同時(shí)觀察pDC315－EGFP在2組細(xì)胞的熒光不同表達(dá)表明H441細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低于HEK293細(xì)胞，這說明 pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后 mCLCA3在H441中的表達(dá)活性顯著高于HEK293細(xì)胞。我們前期的研究［5］表明該SPA啟動(dòng)子在高表達(dá)SPA的細(xì)胞H441中轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)度接近于CMV啟動(dòng)子活性的60%從而顯示其組織特異性，而在無SPA表達(dá)的A549(人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系)也可檢測到顯著低于H441細(xì)胞的熒光素酶的增加，說明可能存在其它機(jī)制調(diào)節(jié)SPA的活性。這或許可以解釋SPA啟動(dòng)的mCLCA3在無SPA啟動(dòng)子表達(dá)的HEK293細(xì)胞中也有mCLC3的表達(dá)。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)顯示 pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H441后有mCLCA3蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后無 mCLCA3蛋白表達(dá);pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后存在mRNA的表達(dá)而無蛋白的表達(dá)可能與轉(zhuǎn)錄后翻譯過程失敗有關(guān)，但這一結(jié)果同時(shí)也說明pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒在H441的靶向表達(dá)性。(3)pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H441和HEK293細(xì)胞后均無熒光表達(dá)，而理論上作為SPA－mCLCA3－EGFP融合基因如果mCLCA3有表達(dá)則應(yīng)該同時(shí)存在EGFP的表達(dá)即在熒光顯微鏡下見到綠色熒光。當(dāng)然無綠色熒光并不能否認(rèn)我們構(gòu)建的靶向表達(dá)載體的功能，理由如下:(1)本課題組前期的研究證明該SPA啟動(dòng)子在H441細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)度接近于CMV啟動(dòng)子活性的60%［5］，但是這一結(jié)論是基于對(duì)熒光素酶活性的檢測，相比之下人們使用GFP蛋白作標(biāo)簽時(shí)常用CMV等強(qiáng)啟動(dòng)子說明GFP需要較強(qiáng)的啟動(dòng)活性［6］。(2)啟動(dòng)子與克隆基因之間的間隔距離也會(huì)影響基因的表達(dá)效率，攜帶克隆基因的質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)研究表明啟動(dòng)子與克隆基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間間隔增加3 bp就已經(jīng)能夠減弱其轉(zhuǎn)譯效率［7］，而我們構(gòu)建的載體EGFP標(biāo)簽位于mCLCA3基因轉(zhuǎn)錄起始的最末端，與SPA啟動(dòng)子間隔2 700余bp，這可能也是EGFP不表達(dá)或表達(dá)過低的原因。EGFP蛋白只是該載體上的一個(gè)標(biāo)簽，利于我們對(duì)pDC315－SPA－mCLCA3的表達(dá)檢測，本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑苯訖z測到mCLCA3 mRNA和蛋白在氣道上皮細(xì)胞系H441中的表達(dá)更能說明該載體在特定細(xì)胞具有表達(dá)功能。這一穿梭質(zhì)粒的成功構(gòu)建為我們進(jìn)一步構(gòu)建腺病毒載體奠定了基礎(chǔ)。

Figure 5.Immunocytochemical staining of mCLCA3 protein in H441 and HEK293 cells transfected with pDC315－EGFP(A:H441 cells;C:HEK293)and pDC315－SPA －mCLCA3(B:H441 cells;D:HEK293)plasmids(SP，×200).A，C，D:no yellow staining;B:yellow staining marked by the black arrows.圖5 pDC315－EGFP和pDC315－SPA－mCLCA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H441和HEK293細(xì)胞后的免疫細(xì)胞化學(xué)圖片

病毒載體因其不同的靶向性、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、安全性、容量等特點(diǎn)而成為目前臨床基因治療和基礎(chǔ)研究中應(yīng)用最多的載體，常用的有腺病毒載體(adenovirus，AV)、腺相關(guān)病毒載體(adeno－associated virus，AVV)及慢病毒載體［8］。盡管研究表明AAV5、AAV6對(duì)氣道上皮細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率而成肺部疾病的理想載體［9］，但因其低容量限制其使用(理論容量＜4 kb)。本研究中，不包括啟動(dòng)子在內(nèi)的目的基因片段為2 742 bp，因此我們選用了同樣對(duì)氣道上皮具有較高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率但高容量的腺病毒載體。與AAV5和AAV6相比，腺病毒載體感染宿主廣泛卻不具有靶向性，因此我們采用組織特異性的啟動(dòng)子將其靶向表達(dá)至氣道上皮細(xì)胞。氣道上皮細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子如 FOXJ1(1 kb)［10］、CCSP(2.3 kb)［11］等先后被成功地用于氣道上皮細(xì)胞的靶向研究，但片段均過長;本課題組亦克隆并證實(shí)了SPA啟動(dòng)子(核心啟動(dòng)子區(qū)163 bp)在高表達(dá)SPA蛋白的氣道上皮細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄靶向活性，為了盡量減少腺病毒載體插入片段的長度，提高轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率，我們將該SPA啟動(dòng)子繼續(xù)用于本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果證實(shí)SPA啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)mCLCA3的靶向表達(dá)，為我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建靶向腺病毒載體進(jìn)而研究mCLCA3在氣道上皮缺陷中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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