鄧小鹿， 彭 鏡， 何 芳， 楊麗芬， 吳麗文， 尹 飛

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院兒科，湖南長(zhǎng)沙410008)

腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)主要由單核細(xì)胞和巨細(xì)胞產(chǎn)生，在介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的炎癥過(guò)程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，感染性腦水腫大鼠腦組織的TNF－α含量明顯增高，與腦水腫的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［1］;Rho激酶抑制劑Y－27632可以減輕TNF－α導(dǎo)致的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高［2］。同時(shí)，已有研究顯示RhoA/Rho激酶信號(hào)通路是調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的重要環(huán)節(jié)，其中RhoA的活性由Rho鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(Rho guanine nucleotide exchange factors， RhoGEFs)催 化。p115RhoGEF是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)聯(lián)系G蛋白偶聯(lián)受體和Rho家族的RhoGEFs，介導(dǎo)多種刺激因素如凝血酶、溶血凝脂酸、血栓素－2對(duì)RhoA的活化［3］。因此，我們認(rèn)為p115RhoGEF可能也參與了TNF－α對(duì)RhoA的調(diào)控，而目前未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)了TNF－α刺激小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)RhoA活性和蛋白表達(dá)水平，并通過(guò)siRNA抑制p115RhoGEF表達(dá)，探討其在TNF－α對(duì)RhoA活性調(diào)控中的作用。

材料和方法

1 材料

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3由美國(guó)芝加哥大學(xué)章堅(jiān)教授饋贈(zèng)，RhoA活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cytoskeleton，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青公司，重組人TNF－α購(gòu)自Sigma，兔抗RhoA單克隆抗體購(gòu)自CST，山羊抗p115RhoGEF多克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Cruz，p115RhoGEF siRNA由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司合成。其余生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┗蜻M(jìn)口分裝。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 應(yīng)用 DMEM(含 10%FBS)培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)bEnd.3細(xì)胞，每3 d按1∶2的比例傳代，每日于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)狀態(tài)，1－2 d更換1次培養(yǎng)液。

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 參考文獻(xiàn)［4］合成p115RhoGEF siRNA。合成引物序列如下:正義鏈5'－CAUACCAUCUCUACCGACGtt－3';反義鏈5'－CGUCGGUAGAGAUGGUAUGtt－3'。采用 Invitrogen公司的Lipofectamine 2000將p115RhoGEF siRNA轉(zhuǎn)染bEnd.3細(xì)胞，無(wú)活性的nsRNA作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染72 h后，利用Western blotting驗(yàn)證siRNA抑制p115RhoGEF蛋白合成的效果。

2.3 RhoA活性和表達(dá)分析及分組 將bEnd.3細(xì)胞分為正常對(duì)照組和TNF－α刺激組。去血清培養(yǎng)24 h，加入TNF－α(10 μg/L)刺激，在 10、30、60 min 利用 pull－ down 法檢測(cè)RhoA活性，得到TNF－α作用與RhoA活化的時(shí)效關(guān)系。取RhoA活化最明顯的時(shí)點(diǎn)，bEnd.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染p115RhoGEF siRNA和nsRNA，檢測(cè)TNF－α刺激后RhoA的活性變化。Pull－down法操作步驟依照Cytoskeleton提供的RhoA活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。Western blotting檢測(cè)RhoA－GTP的表達(dá)，RhoA－GTP/總RhoA的比值代表RhoA活性。

將bEnd.3細(xì)胞分為正常對(duì)照組和TNF－α刺激組。去血清培養(yǎng)24h，分為1、3、6、12、24 h 組，加入 TNF － α(10 μg/L)進(jìn)行預(yù)處理后收集各組總蛋白，Western blotting檢測(cè)RhoA蛋白表達(dá)變化。

2.4 Western blotting 每孔加樣品總蛋白量30 μg行SDSPAGE電泳分離及轉(zhuǎn)膜，Ⅰ抗工作效價(jià)為1∶500，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Quantity One圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影條帶灰度值分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Pull－down檢測(cè)TNF－α對(duì)bEnd.3細(xì)胞RhoA活性的影響

與對(duì)照組相比，bEnd.3細(xì)胞RhoA活性在TNF－α處理10 min無(wú)明顯變化;30 min明顯增高達(dá)到高峰(P＜0.01)，60 min稍下降但仍高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Activation of RhoA by TNF－α.The bEnd.3 cells were incubated in the presence of TNF － α (10 μg/L)for the indicated time.A:RhoA activation was determined by pull－down assay.The RhoA －GTP pulled down from lysates was detected by Western blotting using a specific anti－RhoA antibody.The total amount of RhoA in cell lysates was used as a control for the comparison of RhoA activity.B:quantitation of pulldown experiments.±s.n=3.*P＜0.05.＊＊P＜0.01 vs control.圖1 Pull－down檢測(cè)TNF－α對(duì)bEnd.3細(xì)胞RhoA活性的影響

2 Western blotting檢測(cè)TNF－α對(duì)bEnd.3細(xì)胞RhoA蛋白表達(dá)的影響

RhoA總蛋白表達(dá)在TNF－α刺激12和24h上調(diào)，與對(duì)照組之間的差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Time－course changes in the upregulation of RhoA protein induced by TNF － α (10 μg/L).The bEnd.3 cells were incubated in the presence of TNF－α(10 μg/L)for the indicated time points.A:total proteins were assayed for RhoA by Western blotting.The β －actin in cell lysates was used as a control.B:the expression levels of RhoA were summarized.±s.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖2 TNF－α對(duì)bEnd.3細(xì)胞RhoA蛋白表達(dá)量的影響

3 Western blotting鑒 定 siRNA 對(duì) bEnd.3細(xì) 胞p115RhoGEF表達(dá)的抑制效果

與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 p115RhoGEF siRNA的細(xì)胞p115RhoGEF的表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，分析顯示其蛋白條帶灰度值較對(duì)照組降低約91%，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Suppression of endogenous p115RhoGEF protein by siRNA.A:the bEnd.3 cells were transiently transfected with active siRNA against p115RhoGEF(siRNA)or the non－silencing RNA(nsRNA)and the protein lysates prepared at 72 h.Total proteins were assayed for p115RhoGEF by Western blotting.The β－ actin in cell lysates was used as a control.B:the expression levels of p115RhoGEF were summarized.±s.n=3.＊＊P ＜0.01 vs nsRNA.圖3 siRNA對(duì)p115RhoGEF蛋白表達(dá)的影響

4 Pull－down檢測(cè)p115RhoGEF siRNA對(duì)TNF－α刺激后RhoA活性改變的影響

TNF－α作用30 min后p115RhoGEF siRNA組RhoA有部分活化，但較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，分析顯示其蛋白條帶灰度值較對(duì)照組降低約51%，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Effect of p115RhoGEF siRNA on TNF－α stimulated RhoA activation.A:p115RhoGEF siRNA or nsRNA were transfected into bEnd.3 cells and TNF － α －stimulated RhoA activation was measured by pulldown assay;B:quantitation of pull－down experiments.±s.n=3.*P＜0.05 vs nsRNA.圖4 p115RhoGEF siRNA對(duì)TNF－α刺激后RhoA活性改變的影響

討 論

TNF－α是介導(dǎo)炎癥、感染和其它內(nèi)環(huán)境改變的重要起始因子，可直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致應(yīng)力纖維形成和細(xì)胞收縮。小G蛋白的Rho家族，由Rho、Rac和Cdc42三個(gè)亞家族組成，是一類能結(jié)合GTP的蛋白質(zhì)，并能通過(guò)其下游效應(yīng)蛋白介導(dǎo)多種生物功能包括細(xì)胞骨架形成、黏附、增殖和轉(zhuǎn)錄。近年研究表明，多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子均能激活Rho/Rho激酶途徑，使肌球蛋白輕鏈磷酸化、肌動(dòng)－肌球蛋白交聯(lián)增加、F－actin骨架重組和應(yīng)力纖維生成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞收縮［5］;Rho激酶抑制劑Y－27632可以抑制腫瘤細(xì)胞游走過(guò)程中引起的血管內(nèi)皮單細(xì)胞層電阻下降［6］。為探討TNF－α對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞RhoA的調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)觀察了TNF－α處理bEn.d3細(xì)胞后RhoA的活性和表達(dá)變化，證實(shí)TNF－α(10 μg/L)誘導(dǎo)RhoA活性增高，RhoA－GTP表達(dá)在刺激后30min和60min明顯增加，30min達(dá)到高峰，同時(shí)，總RhoA蛋白在TNF－α刺激后12 h和24 h上調(diào)，與在支氣管平滑肌細(xì)胞的研究結(jié)果一致［7］。我們的結(jié)果表明RhoA參與了TNF－α介導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過(guò)程，RhoA的活性和表達(dá)增加可能是TNF－α損傷內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的機(jī)制之一。

然而，TNF－α激活RhoA的具體機(jī)制仍不明確。RhoA的活化依賴GEFs催化GDP向GTP轉(zhuǎn)化，說(shuō)明GEFs在RhoA活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。p115RhoGEF是1996年由Hart等［8］發(fā)現(xiàn)的特異活化RhoA的GEF;G蛋白α亞單位12/13(Gα12/13)轉(zhuǎn)導(dǎo)激動(dòng)劑(如凝血酶和溶血凝脂酸)的信號(hào)，通過(guò)提高p115RhoGEF的GEF活性來(lái)激活RhoA。同時(shí)，Holinstat等［9］在外周血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)凝血酶誘導(dǎo)的RhoA活化和隨之的細(xì)胞骨架重組需要Gα12/13與蛋白激酶Cα(PKCα)共同對(duì)p115RhoGEF的激活。上述研究提示p115RhoGEF參與了外界刺激對(duì)RhoA活化的調(diào)控，而TNF－α活化RhoA是否受p115RhoGEF調(diào)控尚未見(jiàn)報(bào)道。我們使用RNA干擾技術(shù)成功抑制了p115RhoGEF表達(dá)，在此基礎(chǔ)上予TNF－α刺激，30 min后RhoA活化較對(duì)照組明顯降低，提示抑制p115RhoGEF可以部分阻止TNF－α對(duì)RhoA的激活，證實(shí)p115RhoGEF參與了TNF－α對(duì)RhoA活化的調(diào)控。

綜上所述，TNF－α可以誘導(dǎo)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞RhoA活性增加和表達(dá)上調(diào)，在一定程度上揭示了TNF－α損傷內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制。

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