戴雍月， 邱曉曉， 汪 洋， 倪世容， 郝卯林

(溫州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，浙江溫州325035)

肺缺血/再灌注(ischemia/reperfusion injury，IR)損傷可在肺栓塞溶栓、心肺轉(zhuǎn)流、肺移植等臨床多種情況下發(fā)生，其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，肺I/R期間常出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，在誘導(dǎo)因素(如氧自由基、Ca2+超載)的作用下，多種基因(如 p53、bcl－2/bax、Fas/FasL、IEGs、c－ myc等)、多種蛋白酶(如核酸內(nèi)切酶、caspases)、輔酶(如CytC)及核因子(如核因子－κB)等對(duì)IR損傷中的細(xì)胞凋亡均有調(diào)控作用［1］。近年來研究認(rèn)為，線粒體的功能改變?cè)诩?xì)胞凋亡的發(fā)生中亦起關(guān)鍵性作用，其證據(jù)是:在細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡性改變之前，常常先有線粒體跨膜電位(ΔΨm)的下降，并伴有線粒體內(nèi)膜通透性增大及能量合成障礙［2］。本研究建立在體肺I/R模型，觀察其過程中線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition，MPT)功能的變化，并首次應(yīng)用紅花的主要有效成分羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)進(jìn)行干預(yù)，旨在觀察它對(duì)I/R肺的干預(yù)效應(yīng)并探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物和材料

健康清潔級(jí)SD大鼠50只，雌雄不拘，體重250－300 g，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SYXK浙2005－0061)。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的X－dUTP缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated X －dUTP nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche;Ⅰ抗兔抗大鼠CytC、AIF多克隆抗體由Santa Cruz生產(chǎn)(河北博海生物工程開發(fā)有限公司分裝);Ⅱ抗山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司;PVDF膜購(gòu)自Bio－Rad(杭州寶成公司代理);BCA蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce(上海吉泰新絳生物科技有限公司代理);HSYA由四川維克奇生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)Q－5451，規(guī)格20 mg/支。

2 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型制備

參照Vural等［3］介紹的方法復(fù)制在體肺I/R模型:5%水合氯醛(7 mL/kg)腹腔注射麻醉，氣管內(nèi)插管連接泰盟HX－300動(dòng)物人工呼吸機(jī)控制呼吸，潮氣量每次4－6 mL，呼吸頻率60－80次/min。經(jīng)左第5肋間進(jìn)入胸腔，游離左側(cè)肺門留置阻斷帶，在呼氣末阻斷左肺門(包括血管、支氣管)45 min為缺血期，隨后開放阻斷帶恢復(fù)供血和通氣形成再灌注期。健康SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只:假手術(shù)對(duì)照組(對(duì)照組)、缺血/再灌注1 h組(I/R 1 h組)、缺血/再灌注3 h組(I/R 3 h組)、HSYA干預(yù)+I/R 1 h組(SI 1 h組)和HSYA干預(yù)+I/R 3 h組(SI 3 h組)。對(duì)照組游離左肺門后，不阻斷左肺門，觀察3 h 45 min后留取標(biāo)本;將HSYA 20 mg粉末稀釋至20 mL生理鹽水中，SI 1 h、SI 3 h組分別在缺血前20 min和再灌注即刻經(jīng)尾靜脈注射HSYA(2.0 mg/kg)，其余步驟同IR組;對(duì)照組、I/R 1h和I/R 3h組分別注射同等體積生理鹽水。

3 檢測(cè)指標(biāo)

3.1 肺濕干重比(wet to dry weight ratio，W/D)測(cè)定 取1 g左右左上肺組織稱重為濕重，70℃電熱恒溫干燥箱中烤24 h后稱重為干重，兩者之比即為W/D。

3.2 肺光學(xué)顯微鏡檢查及損傷組織學(xué)定量評(píng)價(jià)取左肺下葉1 cm ×1 cm ×1 cm大小組織塊，4%多聚甲醛固定，行常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，在200倍視野的光鏡下連續(xù)觀察10個(gè)視野，計(jì)算損傷肺泡數(shù)［肺泡內(nèi)含紅細(xì)胞或(和)中性粒白細(xì)胞2個(gè)以上］占計(jì)數(shù)肺泡總數(shù)的百分比，即肺泡損傷數(shù)比值，作為肺損傷定量評(píng)價(jià)指標(biāo)(the index of quantitative assessment of histological lung injury，IQA)。

3.3 肺組織電鏡觀察 冰蠟塊上取左肺門旁0.1 cm ×0.1 cm ×0.1 cm 大小的組織 2 －3 塊，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇丙酮系列梯度脫水后Epon812包埋，超薄切片，醋酸硝酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)。

3.4 肺組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法，按試劑盒提供的方法操作，凋亡的細(xì)胞核呈棕黃色。計(jì)算5個(gè)高倍視野(×400)下的凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=檢測(cè)到的凋亡細(xì)胞數(shù)÷5個(gè)高倍視野檢測(cè)到的細(xì)胞總數(shù)×100%。

3.5 肺組織線粒體提取 采用差速分級(jí)離心法分離線粒體，將1小塊肺組織置預(yù)冷的0.25 mol/L蔗糖溶液中，去除可見的支氣管及血管，在STE(0.25 mol/L 蔗糖、10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH=7.5)液中剪成肉糜，于勻漿機(jī)勻漿后，在高速低溫離心機(jī)(HITACHI 20PR520型)上離心，600×g離心7 min和1 600×g離心5 min，棄沉淀，取上清液經(jīng)12 500×g離心10 min后，棄上清液，沉淀即為肺組織線粒體［4］。線粒體置于重懸液(不含酶)中，用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法測(cè)定其蛋白含量。制備好的線粒體懸液用以線粒體通透性轉(zhuǎn)換功能的檢測(cè)，破膜后用于線粒體細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis－ inducing factor，AIF)的檢測(cè)。

3.6 CytC和AIF蛋白含量測(cè)定 采用免疫印跡法(Western blotting)。稱取凍存肺組織約100 mg，放入預(yù)冷的1 000 μL細(xì)胞裂解液中，冰浴剪碎、勻漿，4℃、3 000 r/min離心3 min，超聲裂解5 s×4次，12 000 r/min離心5 min，吸取上清，分裝，－80℃保存，留1管用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。以每個(gè)樣品的總蛋白為20 μg上樣，進(jìn)行SDS－PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜30 min，Ⅰ抗4℃過夜，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，反復(fù)洗膜、顯色，暗室中X膠片感光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)(Bio－Rad)測(cè)定吸光度值，以目的蛋白條帶吸光度值和內(nèi)參照吸光度的比值代表蛋白的含量。

3.7 MPT孔開放情況檢測(cè) 用線粒體膨脹測(cè)定液(120 mmol/L KCl，20 mmol/L MOPS，10 mmol/L Tris－HCl，5 mmol/L KH2PO4，pH7.4)將線粒體稀釋至蛋白濃度為0.25 g/L，于25 ℃、20 mmol/L CaCl2作用于線粒體，通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其在520 nm處的吸光度值(A520)。該值的下降反映線粒體腫脹程度，提示MPT孔的開放情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 肺組織W/D及IQA

與對(duì)照組相比，各I/R組和 SI組的 W/D、IQA值均升高(P＜0.01);SI各組與I/R組相同時(shí)點(diǎn)比較(即SI 1 h與I/R 1 h比，SI 3 h與I/R 3 h比)，則有顯著下降(P＜0.01)。肺組織HE染色，光鏡下顯示:對(duì)照組肺間質(zhì)及肺泡結(jié)構(gòu)保持完整未見明顯炎癥細(xì)胞;I/R各組肺間質(zhì)增寬水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)可見較多紅細(xì)胞滲出，損傷明顯尤其是I/R 3 h組;各SI組與相同時(shí)點(diǎn)的I/R組比，肺間質(zhì)水腫程度減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞滲出也明顯減少，肺泡結(jié)構(gòu)比較完整，見表1、圖1。

表1 各組W/D和IQA比較Table 1.Comparison of lung W/D and IQA of rats in each group(±s.n=10)

表1 各組W/D和IQA比較Table 1.Comparison of lung W/D and IQA of rats in each group(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs I/R 1 h group;△△P＜ 0.01 vs I/R group at the same time point.I/R 1 h:ischemia/reperfusion 1h;I/R 3 h:ischemia/reperfusion 3 h;SI 1 h:hydroxysafflor yellow A(HSYA)+I/R 1 h;SI 3 h:HSYA+I/R 3 h;W/D:wet to dry weight ratio;IQA:the index of quantitative assessment of histological lung injury.

Group W/D IQA Control 5.18 ±0.37 14.74 ±4.35 I/R 1 h 6.03 ±0.23＊＊ 37.72 ±3.54＊＊I/R 3 h 6.32 ±0.25＊＊## 47.35 ±4.76＊＊##SI 1 h 5.45 ±0.20＊＊△△ 17.64 ±3.85＊＊△△SI 3 h 5.71 ±0.26＊＊△△ 20.76 ±4.97＊＊△△

2 肺組織超微結(jié)構(gòu)改變

對(duì)照組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器無明顯損傷。I/R各組肺組織損傷明顯，其程度隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而加重，血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫變性、線粒體空泡化、核染色質(zhì)邊集、核膜皺縮、胞漿濃縮，基底部與彈力板分離呈“拱橋”樣變，炎癥細(xì)胞附壁增多;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞微絨毛脫落明顯，核固縮，胞漿濃縮，胞漿內(nèi)板層小體數(shù)量疏松、排空增多;肺泡腔內(nèi)水腫液、紅細(xì)胞也逐漸增多，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)且吞噬小體豐富。SI 1 h組細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常改變不明顯。SI 3 h組較I/R 3 h組損傷明顯減輕，見圖2。

3 肺組織細(xì)胞凋亡情況

對(duì)照組偶見肺組織細(xì)胞少量凋亡，I/R各組細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯增加(均P＜0.01)，且隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)呈動(dòng)態(tài)變化:I/R 3 h組高于I/R 1 h組;各SI組細(xì)胞凋亡與各I/R組同一時(shí)點(diǎn)比較明顯減少，其凋亡指數(shù)差異顯著(P＜0.01)。TUNEL染色陽性細(xì)胞(胞核呈棕黃色)主要為肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，見表2、圖3。

Figure 1.Histology of the left lungs of rats in each group under light microscope(HE staining，×200).A:control group;B:ischemia/reperfusion 1 h(I/R 1 h)group;C:I/R 3 h group;D:HSYA+I/R 1 h(SI 1 h)group;E:SI 3 h group.圖1 各組左肺組織光鏡下結(jié)構(gòu)

Figure 2.Ultrastructure changes in lung tissues of rats in three groups(×12 000).A:control group;B:ischemia/reperfusion 1 h(I/R 1 h)group;C:I/R 3 h group;D:HSYA+I/R 1 h(SI 1 h)group E:SI 3 h group.圖2 各組肺組織超微結(jié)構(gòu)

表2 各組 AI和A520比較Table 2.Comparison of AI and A520of rat lungs in each group(±s.n=10)

表2 各組 AI和A520比較Table 2.Comparison of AI and A520of rat lungs in each group(±s.n=10)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group;##P ＜ 0.01 vs I/R 1 h group;△△P ＜0.01 vs I/R group at the same time point.I/R 1 h:ischemia/reperfusion 1 h;I/R 3 h:ischemia/reperfusion 3 h;SI 1 h:hydroxysafflor yellow A(HSYA)+I/R 1 h;SI 3 h:HSYA+I/R3 h;AI:apoptotic index;A520:the absorbance at 520 nm.

Control 1.66 ±0.71 0.910 ±0.035 I/R 1 h 8.71 ±1.54＊＊ 0.500 ±0.017＊＊I/R 3 h 17.73 ±2.08＊＊## 0.290 ±0.034＊＊##SI 1 h 5.03 ±1.75＊＊△△ 0.800 ±0.034＊＊△△SI 3 h 9.40 ±2.09＊＊△△ 0.400 ±0.033＊＊△△

4 MPT功能測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，其余各組線粒體在520 nm處的吸光度值均下降(P＜0.01);SI 1 h組線粒體在520 nm處的吸光度值下降程度小于I/R 1 h組;SI 3 h組線粒體在520 nm處的吸光度下降程度小于I/R 3 h組，見表2。

5 肺組織細(xì)胞線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)CytC蛋白含量的Western blotting結(jié)果

與對(duì)照組相比較，其余各組CytC胞漿含量增加而線粒體內(nèi)含量減少;SI 1 h組、SI 3 h組胞漿內(nèi)CytC含量分別低于I/R 1 h組和I/R 3 h組(P＜0.01)，而SI 1 h組、SI 3 h組線粒體內(nèi)CytC含量則明顯高于I/R 1 h組和 I/R 3 h組(P ＜0.01)，見圖4。

Figure 3.Apoptosis state of pneumocytes in different groups(TUNEL，×400).A:control group;B:ischemia/reperfusion 1 h(I/R 1 h)group;C:I/R 3 h group D:HSYA+I/R 1 h(SI 1 h)group E:SI 3 h group.圖3 各組肺組織細(xì)胞凋亡情況

6 肺組織細(xì)胞線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)AIF蛋白含量的Western blotting結(jié)果

其變化趨勢(shì)同CytC，與對(duì)照組相比較，其余各組AIF胞漿含量增加而線粒體內(nèi)含量減少;SI組AIF與I/R組同一時(shí)點(diǎn)比較，胞漿內(nèi)含量減少而線粒體內(nèi)含量增加，見圖5。

7 相關(guān)性分析

將肺組織細(xì)胞AI與W/D、IQA、胞漿內(nèi)CytC和胞漿內(nèi)AIF作相關(guān)分析表明，AI與W/D、IQA、胞漿內(nèi)CytC、AIF之間均呈非常顯著的正相關(guān)關(guān)系(分別r=0.824，r=0.883，r=0.821，r=0.811，均 P ＜0.01)。

Figure 4.Western blotting analysis for the levels of cytochrome C(CytC).A:control group;B:ischemia/reperfusion 1 h(I/R 1 h)group;C:I/R3 h group;D:HSYA+I/R 1 h(SI 1 h)group;E:SI 3 h group.±s.n=10.＊＊P ＜ 0.01 vs control group;△△P ＜ 0.01 vs I/R group at the same time point.圖4 免疫印跡法分別檢測(cè)線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C的情況

Figure 5.Western blotting detecting for the levels of apoptosisinducing factor(AIF).A:control group;B:Ischemia/reperfusion 1 h(I/R 1 h)group;C:I/R 3 h group;D:HSYA+I/R 1 h(SI 1 h)group;E:SI 3 h group.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs control group;△△P ＜ 0.01 vs I/R group at the same time point.圖5 免疫印跡法分別檢測(cè)線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)凋亡誘導(dǎo)因子的情況

討 論

細(xì)胞凋亡是I/R損傷后細(xì)胞死亡的主要方式之一。隨著線粒體醫(yī)學(xué)的發(fā)展，以及對(duì)I/R機(jī)制的深入研究，學(xué)者們認(rèn)為，MPT孔在I/R時(shí)細(xì)胞存活和死亡中扮演著重要角色［5］。MPT孔是橫跨在線粒體內(nèi)外膜之間非選擇性高導(dǎo)電性通道，由線粒體膜蛋白的構(gòu)象改變而形成，被認(rèn)為是一種蛋白復(fù)合體。其組成包括位于線粒體內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶、位于線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道和位于線粒體基質(zhì)的環(huán)孢菌素 A 受體D［6］。Akao等［7］用培養(yǎng)的心肌研究H2O2誘導(dǎo)的心肌損傷，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡分為不同階段，啟動(dòng)階段:包括ROS和Ca2+依賴的線粒體形態(tài)改變(膨脹和脊的重塑)，但仍能維持Δψm;去極化階段:MPT誘導(dǎo)Δψm去極化;最后是破裂階段:基質(zhì)高度膨脹，線粒CytC釋放和線粒體表面膜改變。Kim等［8］在研究肝I/R時(shí)也觀察到線粒體膜去極化，膜電位下降，線粒體腫脹，釋放CytC和AIF，最終引起細(xì)胞死亡。目前關(guān)于肺I/R中細(xì)胞凋亡的研究少見報(bào)道。本研究通過復(fù)制在體大鼠肺I/R模型，TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，control組偶見細(xì)胞凋亡;I/R 1 h組、I/R 3 h組肺組織細(xì)胞(包括肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)凋亡明顯增加(均P＜0.01)，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，I/R 3 h組AI明顯高于I/R 1 h組(均P＜0.01)，且凋亡指數(shù)(AI)與W/D及IQA均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)電鏡顯示，肺組織超微結(jié)構(gòu)破壞隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，并觀察到血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞染色質(zhì)邊集，核固縮現(xiàn)象。以上結(jié)果均提示，細(xì)胞凋亡可能在肺I/R損傷中起重要作用。

正常情況下，CytC主要存在于線粒體內(nèi)外膜之間的間隙中，在線粒體氧化磷酸化功能中發(fā)揮重要作用，而在胞漿少量表達(dá)。當(dāng)缺血缺氧及再灌注等病理因素導(dǎo)致MPT孔異常開放，線粒體氧化磷酸化失偶聯(lián)，基質(zhì)腫脹，外膜破裂時(shí)CytC與其它促凋亡物質(zhì)(如AIF)則會(huì)釋放入胞漿，與凋亡蛋白酶誘導(dǎo)因子－1(Apaf－1)和caspase－9前體結(jié)合并活化之，導(dǎo)致caspase－9依賴的caspase－3的激活、DNA斷裂和細(xì)胞凋亡［9］。本實(shí)驗(yàn)MPT功能測(cè)定及Western blotting結(jié)果均證實(shí)了這一點(diǎn)，分光光度計(jì)顯示I/R后線粒體 A520較control組明顯下降，尤其是I/R 3 h組(P＜0.01)，該值下降反映線粒體腫脹程度，提示MPT孔的開放情況;同時(shí)與control組相比較，I/R組CytC和AIF胞漿含量顯著增加，而線粒體內(nèi)含量明顯減少。且在做相關(guān)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，AI與胞漿內(nèi)CytC、AIF之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(分別 r=0.821，r=0.811，均 P ＜0.01)。因此，綜合前述結(jié)果可認(rèn)為，線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)在肺I/R引起的細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色。有研究表明，I/R過程中，線粒體Ca2+超載，大量氧自由基生成帶來的氧化應(yīng)激效應(yīng)，腺嘌呤核苷酸的耗竭，以及線粒體膜的去極化是MPT孔開放的關(guān)鍵因素［10］。

紅花是傳統(tǒng)的活血化瘀類代表藥物，紅花中含有紅花苷、紅花素、黃花素和總黃酮、脂肪酸、色素、揮發(fā)油以及多炔等多種物質(zhì)，具有舒張血管、抗凝、提高耐缺氧能力等作用，臨床用于治療缺血性心臟病、腦中風(fēng)等獲得良好療效［11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，紅花還能抑制細(xì)胞凋亡，減輕心、腦、腸道等臟器缺血再灌注損傷［12，13］。我們?cè)谝酝难芯恐幸沧C實(shí)了紅花注射液可通過下調(diào)促凋亡基因bax的表達(dá)，提高Bcl－2/Bax比值以及下調(diào)caspase－3基因的表達(dá)，減少肺組織細(xì)胞凋亡，從而一定程度上保護(hù)了缺血再灌注肺組織［14］。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用紅花的主要有效成分HSYA對(duì)肺缺血再灌注進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明，HSYA顯著降低了W/D和IQA值(P＜0.01)，明顯減少了肺組織細(xì)胞凋亡，SI 1 h與I/R 1 h比，SI 3 h與I/R 3 h比，其凋亡指數(shù)有顯著差異(P＜0.01)。光鏡和電鏡均證實(shí)了HSYA在一定程度上減輕I/R后肺組織結(jié)構(gòu)的損傷。此外，HSYA還能減少CytC和AIF在胞漿內(nèi)的含量，增加其在線粒體內(nèi)的含量，且SI各組與同一時(shí)相I/R各組比，MPT的程度也明顯下降。因此，我們認(rèn)為，HSYA對(duì)I/R肺組織具有保護(hù)作用，該作用可能與HSYA抑制I/R誘導(dǎo)的肺組織細(xì)胞線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換，減少CytC、AIF等凋亡關(guān)鍵物質(zhì)的釋放有關(guān)。結(jié)合以往的研究結(jié)果推測(cè)，HSYA保護(hù)線粒體的功能可能與下調(diào)促凋亡基因bax的表達(dá)，提高Bcl－2/Bax比值有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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