朱曉波， 徐志偉， 姜文靜

(河北北方學(xué)院1生化教研室，2臨床檢驗教研室，河北 張家口075000)

臨床資料分析指出，保留脾的遠(yuǎn)端胰腺切除比胰腺合并脾切除有更低的糖尿病發(fā)生率［1，2］。這些臨床觀察提示脾對胰島功能的可能保護作用。脾的這一作用也得到了實驗證實。NOD(non-obese diabetic)小鼠是一種典型自身免疫性1型糖尿病模型，出生一段時間后，由于自身淋巴細(xì)胞逐漸浸潤胰島組織，出現(xiàn)胰腺炎，導(dǎo)致高血糖出現(xiàn)。2003年Morin等［3］在NOD小鼠的研究指出，NOD小鼠脾可以產(chǎn)生一類CD11c+/CD11b+樹突狀細(xì)胞，給尚未生成糖尿病的NOD小鼠注射這類樹突狀細(xì)胞，可以阻止NOD小鼠發(fā)展成糖尿病。2007年Zhou等［4］的研究指出聚肌胞苷酸預(yù)防NOD小鼠形成糖尿病的機制涉及脾細(xì)胞Th2漂移誘導(dǎo)［4］。上述研究表明，脾在預(yù)防NOD小鼠糖尿病發(fā)生的作用僅與免疫機制相關(guān)，但并不能全面表明脾對胰島功能的保護作用。在正常小鼠，對于化學(xué)毒素鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)特異破壞的胰島β細(xì)胞，脾是否存在保護作用，未見報道。于是，我們對此進行了研究。通常，單次高劑量STZ注射可以引起實驗動物胰島β細(xì)胞大量死亡，導(dǎo)致血糖水平的穩(wěn)定增加及1型糖尿病的出現(xiàn)。本研究中，我們以單次注射并不引起糖尿病劑量的STZ處理預(yù)先切除脾的小鼠，分析空腹血糖及血清胰島素水平變化，進而觀察細(xì)胞總量、細(xì)胞凋亡和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，以探討脾對STZ損傷胰島β細(xì)胞是否具有保護作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康4周齡雄性昆明種小鼠120只，體重(20±2)g，由首都醫(yī)科大學(xué)提供。

1.2 主要試劑、藥物 STZ購自Sigma;葡萄糖試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司;胰島素放射免疫分析試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所;小鼠抗胰島素單克隆抗體購自武漢博士德公司;AEC顯色試劑購自福州邁新生物公司;膠原酶V和Dextran T40購自Pharmacia;細(xì)胞凋亡ELISA試劑盒購自Boehringer Mannheim;Luminol化學(xué)發(fā)光法測定ROS試劑盒購自百事創(chuàng)新北京科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 脾切除小鼠模型制備 將60只昆明小鼠按Yin等［5］的方法進行脾切除，即:小鼠以1%戊巴比妥麻醉(45 mg/kg BW，ip)，常規(guī)消毒，開腹，剝離脾臟，結(jié)扎脾動脈和靜脈，將脾全部切除，縫合。

2.2 動物分組及實驗處理 脾切除2 d后，將脾切除小鼠60只空腹14 h后，隨機分為3組，每組20只，分別以80 mg/kg、160 mg/kg STZ給小鼠腹腔注射，STZ臨用前，溶于冰冷的0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.4)配成濃度為1%溶液，在冰冷狀態(tài)下完成注射;另一組腹腔注射生理鹽水，作為脾切除小鼠的STZ對照組。未切除脾的正常小鼠60只空腹14 h后隨機分為3組，每組20只，分別以80 mg/kg、160 mg/kg STZ給小鼠腹腔注射，另一組腹腔注射生理鹽水，作為正常對照。STZ處理后小鼠自由飲水，4 h后自由進食標(biāo)準(zhǔn)飼料。

2.3 觀察指標(biāo)及測定方法

①空腹血糖和血清胰島素測定 STZ處理1周后，各組小鼠空腹8 h，隨機取10只小鼠，用毛細(xì)玻璃管由眼球后靜脈叢采血，離心(1 088×g，5 min)制備血清，以葡萄糖氧化酶法試劑盒測定小鼠空腹血糖，間接放免法測定血清胰島素。

②β細(xì)胞總量測定 STZ處理1周后，將各組小鼠(n=6)以戊巴比妥(45 mg/kg BW，ip)麻醉，取胰腺組織，10%甲醛固定24 h后脫水，石蠟包埋，切片，免疫組化AEC顯色，胰島素陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色，免疫組化操作嚴(yán)格按照試劑盒規(guī)定步驟進行。β細(xì)胞總量分析是利用胰腺組織的免疫組化切片低倍鏡下圖像在Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)和中國醫(yī)科院聯(lián)合研制)分別定量胰島β細(xì)胞面積及所有組織面積。每塊胰腺組織取3張切片，每個切片的80%被分析以估計胰島β細(xì)胞和所有組織面積。以胰島素染色陽性面積與所有組織面積比值表示β細(xì)胞總量。

③細(xì)胞凋亡測定 胰島分離:STZ處理1周后，頸椎脫臼處死小鼠(n=6)，取出胰腺。將胰腺剪成約1mm×1mm×1mm小塊，膠原酶V消化。在37℃的恒溫水浴箱中振蕩消化約15min，直至瓶內(nèi)組織變成細(xì)泥沙狀，鏡下發(fā)現(xiàn)大多數(shù)胰島已完整地從外分泌腺中分離出來，加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640終止消化。60目篩網(wǎng)過濾。4℃HBSS溶液洗滌2次。離心沉淀物與預(yù)先配置的34%dextran 1∶4混合，充分混勻，依次緩慢加入濃度為22%、11%dextran 各 2 mL，最上為 RPMI-1640 1.5 mL。174×g離心5 min，繼之392×g再離心5 min，收集22%與11%、11%與RPMI-1640兩個界面之間的組織，以Hanks液洗滌2次，即純化胰島。細(xì)胞凋亡測定:應(yīng)用 Boehringer Mannheim公司細(xì)胞凋亡ELISA試劑盒檢測細(xì)胞核DNA斷裂形成的單核小體和多核小體，操作方法按試劑盒說明書進行。將純化胰島用膠原酶V進一步消化成單細(xì)胞，以裂解緩沖液在室溫下裂解30 min，200×g離心10 min，上清液用ELISA試劑進行細(xì)胞凋亡測定，以酶標(biāo)儀于405 nm波長處測定吸光度(absorbance，A)值，結(jié)果用凋亡細(xì)胞核小體的聚集值表示，聚集值=(樣品A值-本底A值)/陰性對照A值。

④胰腺ROS測定 STZ處理1周后，由正常及脾切除的對照組小鼠(n=6)取胰腺組織，制備組織勻漿液，200×g離心10 min，取上清液-20℃保存待測。Luminol化學(xué)發(fā)光法測定上清液ROS，按試劑盒說明及要求操作?？捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 各實驗組小鼠空腹血糖濃度

正常對照組、80 mg/kg STZ處理正常組及脾切除小鼠的STZ對照組小鼠空腹血糖水平均在正常范圍，各組數(shù)值無顯著差異。80 mg/kg STZ處理脾切除組空腹血糖濃度顯著升高［(15.15±2.36)mmol/L］，與同劑量 STZ 處理正常組［(5.68 ±1.36)mmol/L］相比差異顯著(P＜0.01)。160 mg/kg STZ處理脾切除組和同劑量STZ處理正常組血糖與正常對照組相比，均有顯著差異，見表1。

表1 不同劑量STZ處理的各組小鼠空腹血糖、血清胰島素濃度及胰島β細(xì)胞總量Table 1.Fasting blood glucose(FBG)，serum insulin concentrations and islet β-cell mass in various groups of mice(±s)

表1 不同劑量STZ處理的各組小鼠空腹血糖、血清胰島素濃度及胰島β細(xì)胞總量Table 1.Fasting blood glucose(FBG)，serum insulin concentrations and islet β-cell mass in various groups of mice(±s)

＊＊P ＜0.01 vs normal mice treated with 80 mg/kg STZ.

rea 160mg/kg STZ 10 24.92 ±3.90 10 19.84 ±3.95 6 0.20 ±0.03

2 各實驗組小鼠空腹血清胰島素濃度

STZ處理1周后，80 mg/kg STZ處理的脾切除組小鼠血清胰島素水平降低［(21.68±4.23)mIU/L］，與同劑量 STZ處理正常組［(34.23±3.63)mIU/L］、正常對照組及脾切除小鼠的STZ對照組相比差異顯著(P＜0.01)，而與160 mg/kg STZ處理的脾切除組和正常組相比無顯著差異，見表1。

3 胰島β細(xì)胞總量變化

免疫組化結(jié)果顯示，完全脾切除小鼠β細(xì)胞總量(0.60±0.02)與正常小鼠相比，無顯著差異。80 mg/kg STZ處理的脾切除組 β細(xì)胞總量(0.28±0.04)與同劑量 STZ處理的正常對照組(0.55±0.02)相比顯著減少(P＜0.05);而160 mg/kg STZ處理的正常及脾切除組小鼠β細(xì)胞總量減少更明顯，見表 1、圖 1。

Figure 1.Immunohistochemical staining of islets in various groups of mice treated with different doses of STZ(×100).A:normal control mice;B:normal mice treated with 80 mg/kg STZ;C:normal mice treated with 160 mg/kg STZ;D:splenectomy control mice;E:splenectomy mice treated with 80 mg/kg STZ;F:splenectomy mice treated with 160 mg/kg STZ.圖1 不同劑量STZ處理的各組小鼠胰島免疫組化染色

4 STZ誘導(dǎo)的正常和脾切除小鼠胰島細(xì)胞的凋亡

ELISA分析表明，脾切除并不增加胰島細(xì)胞的凋亡，脾切除小鼠的STZ對照組與正常對照胰島細(xì)胞凋亡聚集值無顯著差異;80 mg/kg STZ處理的脾切除組細(xì)胞凋亡聚集值顯著增加，與同劑量STZ處理的正常組相比差異顯著(P＜0.05)，與160 mg/kg STZ處理的脾切除組和正常組相比無顯著差異，見圖2。

5 正常及脾切除小鼠胰腺組織ROS水平

完全脾切除增加了小鼠胰腺組織ROS水平與正常對照相比差異顯著(P＜0.05);80 mg/kg STZ明顯增加了脾切除小鼠胰腺組織ROS水平，與同劑量STZ處理的正常組小鼠相比差異顯著(P＜0.05)，與160 mg/kg STZ處理的脾切除組和正常組相比無顯著差異，見圖3。

Figure 2.Apoptosis of islet cells in various groups of mice detected by ELISA.The result was shown by enrichmen factor.±s.n=6.*P＜0.05 vs normal mice treated with 80 mg/kg STZ.圖2 ELISA測定的各組小鼠胰島細(xì)胞凋亡

Figure 3.Pancreatic ROS production in various groups of mice by luminol-enhanced chemiluminescence.±s.n=6.*P ＜ 0.05 vs normal mice treated with 80 mg/kg STZ;△P ＜0.05 vs normal control mice.圖3 Luminol化學(xué)發(fā)光法測定的各組小鼠胰腺組織ROS水平

討 論

在正常小鼠，單次腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病形成所需最低劑量為125 mg/kg［6］，一般為160-200 mg/kg。本研究表明，在脾完全切除條件下，80 mg/kg劑量的STZ也可以誘導(dǎo)昆明小鼠糖尿病，而正常小鼠在同樣條件下則不發(fā)生糖尿病。并且，糖尿病發(fā)生率達(dá)80%(結(jié)果未顯示)。這一結(jié)果提示了脾對胰島的保護作用，也進一步支持臨床觀察事實:遠(yuǎn)端部分胰腺合并脾切除患者糖尿病發(fā)生率顯著高于單純胰腺切除患者［1，2］。

在影響胰島功能方面，脾表現(xiàn)了雙向性。一方面，脾參與了胰島β細(xì)胞損傷，連續(xù)多次低劑量STZ通過T-脾細(xì)胞破壞胰島β細(xì)胞誘導(dǎo)實驗動物免疫損傷型糖尿病;非CD4脾細(xì)胞促進浸潤性胰島炎形成，參與了NOD小鼠糖尿病形成［7］。另一方面，脾又顯示了對胰島的保護作用，在NOD小鼠，一種自身免疫性1型糖尿病模型，脾參與了胰島的保護作用，這一作用與其淋巴細(xì)胞作用相關(guān)［3，4］。在昆明小鼠，本研究表明，脾保護了低劑量STZ對胰島β細(xì)胞的破壞。

STZ是一種特異破壞胰島β細(xì)胞的化學(xué)毒素，連續(xù)多次低劑量STZ的毒性作用涉及早期對胰島β細(xì)胞的特異損傷及隨后的淋巴細(xì)胞對胰島浸潤造成的免疫性損傷［8］。本研究對單次低劑量STZ處理脾切除小鼠胰島形態(tài)學(xué)觀察未發(fā)現(xiàn)有淋巴細(xì)胞浸潤及胰島炎出現(xiàn)，僅胰島細(xì)胞損傷，提示該條件下STZ主要是對胰島β細(xì)胞的直接作用。

有研究表明，由于胰島β細(xì)胞的抗氧化能力較低，對氧的改變非常敏感，ROS過量產(chǎn)生是介導(dǎo)胰島細(xì)胞損傷的重要早期事件［9］，STZ也引起ROS的產(chǎn)生，并通過多種機制參與胰島的破壞作用［10］。為此，我們檢測了正常及脾切除各組小鼠胰腺組織ROS水平。結(jié)果顯示脾切除小鼠胰腺組織ROS相對正常小鼠顯著增加(圖3)。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因不明，或許與脾切除影響了胰腺組織血液供給有關(guān)。80 mg/kg STZ處理的脾切除組ROS水平與160 mg/kg STZ處理的脾切除組和正常組相比無顯著差異，脾切除引起的ROS增加或許是80 mg/kg劑量的STZ損傷胰島β細(xì)胞而引起小鼠高血糖的原因。這一研究有助于深入了解脾與胰島功能的關(guān)系，及理解脾合并胰腺切除為什么有更高的糖尿病發(fā)生率。

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