趙艷芝， 張冬梅， 于剛剛， 曾翔俊， 王紅霞， 蘆玲巧， 張立克， 王巖梅△

(1首都醫(yī)科大學燕京醫(yī)學院生理與病理生理教研室，北京101300;2首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理教研室，北京100069)

隨著抗缺血/再灌注損傷(ischemic/reperfusion，I/R)心肌自身保護研究的不斷深入，近年來提出了缺血后處理(ischemic postconditioning，IPo)的概念［1］。大量研究證實缺血后處理具有縮小心肌梗死范圍［2］、減輕內(nèi)皮功能損傷、抗再灌注心律失常、改善心肌代謝及收縮和舒張功能、減輕超微結(jié)構(gòu)的破壞等心肌保護作用［3］，減輕細胞凋亡［4］。缺血后處理對心臟再灌注的干預發(fā)生在缺血后，比缺血預處理(ischemic preconditioning，IPc)有明顯的臨床應用優(yōu)勢，故后處理越來越受到醫(yī)學界的廣泛關注。但后處理通過怎樣的機制減輕缺血/再灌注損傷?通過哪種細胞信號轉(zhuǎn)導方式發(fā)揮保護作用?尚不明了。通過在體及離體實驗我室前期工作已證明缺血后處理與細胞色素P450表氧化酶2J3/環(huán)氧二十碳三烯酸系統(tǒng)(cytochrome P450 2J3/epoxyeicosatrienoic acids，CYP2J3/EETs)上調(diào)密切相關［2，5］。鑒于 11，12 －EET具有抑制內(nèi)皮細胞凋亡作用［6］，IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)，進而抑制心肌細胞凋亡而保護心肌?值得探討。本工作通過觀察干預內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)對缺氧后處理(hypoxia postconditioning，HPost)心肌細胞凋亡蛋白的影響，了解缺氧后處理上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)后發(fā)揮心臟保護的可能作用途徑。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 胰蛋白酶(Hyclone)、膠原酶Ⅰ、Ⅱ(Sigma)、絲裂霉素 C(Roche)、DMEM(Hyclone);環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)純品及空白對照(Sigma)、無水乙腈(Fisher Scientifid)、甲酸(Sigma－Aldrich Chemic GmbH，Riedstr)、N，N －diisopropylethy lamine(Sigam)、固相提取柱(Waster Corporation);caspase－3活性檢測試劑盒(Roche)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天試劑公司)、caspase－3抗體(Santa Cruz)、Western blotting發(fā)光試劑盒(Pierce);DMSO(Sigma);細胞色素P450表氧化酶抑制劑6－(2－炔丙基氧苯基)己酸［6－(2－propargyloxyphenyl)hexanoic acid，PPOH］(Sigma);pcDNA3.12－CYP2J3質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建。

1.2 主要儀器 超速低溫離心機(Sigma)、細胞培養(yǎng)箱(Revco)、酶標儀(Labsystems)、低溫冰箱(Sanyo)。

1.3 動物 Wistar乳鼠(12－24 h)由首都醫(yī)科大學動物部提供。

2 方法

2.1 心肌細胞原代培養(yǎng)及缺氧/復氧(H/R)模型復制 取Wistar乳鼠(12－24 h)心臟做原代心肌細胞培養(yǎng)［7］。碘酒及乙醇消毒乳鼠胸腹部，開胸取其心臟的心室部分放入含PBS的燒杯內(nèi)沖洗2次，洗凈血液后剪碎心臟成1 mm×1 mm ×1 mm，各加5 mL 1.25 g/L胰酶、1 g/L膠原酶Ⅰ、0.5 g/L膠原酶Ⅱ，37℃水浴消化(加轉(zhuǎn)子)4 min，首次消化液去掉，后5次消化液收集，按1∶1混合20%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含青－鏈霉素100 mg/L)終止消化。用80目篩網(wǎng)過濾1次，配平后1 000 r/min離心10 min棄去上清，加完全培養(yǎng)基至24 mL，吹打均勻，放入1個培養(yǎng)瓶中，加入絲裂霉素C(2 kg/L)抑制成纖維細胞增殖，20 min、37℃培養(yǎng)，差速貼壁去掉成纖維細胞。免疫組化方法α－action染色鑒定心肌細胞。

將細胞放入自制的缺氧罐內(nèi)，通入混合氣體(O22%，CO25%，N293%)3 h后再將細胞取出，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中復氧2 h。

2.2 實驗分組 (1)對照組(control):細胞用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，不經(jīng)任何處理，繼續(xù)培養(yǎng)5 h;(2)缺氧/復氧組(H/R):按上述方法進行缺氧復氧處理;(3)缺氧后處理組(HPost):心肌細胞缺氧3 h后，采用缺氧罐內(nèi)5 min、復氧5 min重復3次的方法進行后處理，再繼續(xù)復氧85 min;(4)空質(zhì)粒組:按照 2 μg pcDNA3.12 質(zhì)粒/1×105個細胞進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后處理同HPost組;(5)CYP2J3 轉(zhuǎn)染組:按照 2 μg pcDNA3.12－CYP2J3質(zhì)粒/1×105個細胞進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后處理同HPost組;(6)DMSO溶劑組:按照3 μL DMSO/L培養(yǎng)液進行抑制，加入DMSO 24 h后處理同HPost組;(7)PPOH組:按照3μL PPOH/L培養(yǎng)液進行抑制，24 h后處理同HPost組。

3 觀察指標

3.1 MTT法檢測細胞活力［8］取96孔培養(yǎng)板中各組細胞，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，微量振蕩器上震搖10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀490 nm下測定各孔吸光度值(A)。

3.2 高效液相色譜法(high－performance liquid chromatography，HPLC)檢測心肌細胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度［9］對心肌組織進行處理和衍生后上機檢測樣品，流動相:A相0.5%甲酸水溶液，B相0.5%甲酸乙腈溶液，流速1 mL/min，層析條件:前40 min B相濃度由50%增至65%，其后80 min B相濃度由65%增至100%，最后以B相100%維持20 min。

3.3 心肌細胞caspase－3蛋白含量 提取細胞蛋白，按BCA蛋白定量試劑盒說明書定量蛋白，采用Western blotting方法測定各組細胞caspase－3蛋白表達變化。

3.4 心肌細胞caspase－3蛋白活性測定 提取心肌細胞蛋白，按Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天試劑公司)說明書定量蛋白，采用caspase－3蛋白活性檢測試劑盒按照說明書測定caspase－3蛋白活性。

4 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 原代心肌細胞培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞在光鏡下呈棱型或多角形伸展，中間較厚，逐漸形成細胞簇或細胞單層，可自然搏動，頻率約為50次/min;用抗肌動蛋白αactin的單克隆抗體鑒定心肌細胞呈陽性，陽性率達95%，胞漿呈淡棕色，清晰可見心肌細胞肌絲結(jié)構(gòu)，見圖 1、2。

2 MTT法檢測細胞活力

H/R組心肌細胞活力明顯低于control組(P＜0.01)，HPost組心肌細胞活力高于 H/R組(P＜0.01)，PPOH組心肌細胞活力明顯低于 HPost組(P＜0.01)，CYP2J3組心肌細胞活力明顯高于HPost組(P＜0.01)。PPOH組與DMSO組之間差異顯著(P＜0.05)，CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 1.Cultured neonatal rat cardiac myocytes(×200).圖1 培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞

Figure 2.Identification of cultured neonatal rat cardiac myocytes with immunohistochemical staining using antibody to α－actin(×200).圖2 乳鼠心肌細胞鑒定

Figure 3.The effects of CYP2J3/EETs system on livability of cardiac myocytes.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲P＜0.05 vs PPOH group;○○P ＜0.01 vs CYP2J3 group.圖3 CYP2J3/EET系統(tǒng)對心肌細胞活力的影響

3 大鼠心肌細胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度的變化

采用HPLC檢測心肌細胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H/R組心肌細胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度低于對照組(P＜0.01)，HPost組心肌細胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度明顯高于H/R組(P＜0.01)，PPOH抑制劑組明顯低于 HPost組(P＜0.01)，CYP2J3轉(zhuǎn)染組明顯高于 HPost組(P＜0.01)。PPOH組與DMSO組之間有顯著差異(P＜0.01)，CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P＜0.01)，見圖4。

4 心肌細胞caspase－3蛋白含量的變化

H/R組心肌細胞內(nèi)caspase－3蛋白的表達比對照組高(P＜0.05)，HPost組心肌細胞內(nèi)caspase－3蛋白的表達明顯低于H/R組(P＜0.01)，CYP2J3轉(zhuǎn)染組蛋白的表達明顯低于 HPost組(P＜0.01)，PPOH組蛋白的表達高于 HPost組(P＜0.01)。PPOH組于 DMSO組之間差異顯著(P＜0.01)，CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P＜0.05)，見圖 5。

5 心肌細胞caspase－3蛋白活性

H/R組心肌細胞內(nèi)caspase－3蛋白活性比對照組高(P＜0.01)，HPost組心肌細胞內(nèi)caspase－3蛋白活性明顯低于H/R組(P＜0.01)，空質(zhì)粒組活性明顯高于HPost組(P＜0.01)，CYP2J3轉(zhuǎn)染組活性明顯低于空質(zhì)粒組(P＜0.01)，PPOH組活性高于HPost組(P＜0.01)。PPOH組于DMSO組之間差異顯著(P ＜0.01)，見圖6。

Figure 4.The alterations of 11，12 － EET concentration in cardiomyocyte culture medium.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;Empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲▲P ＜0.01 vs PPOH group;○○P ＜0.01 vs CYP2J3 group.圖4 心肌細胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度的變化

Figure 5.The expression of caspase－3 protein in cardiomyocytes.The caspase－3 protein levels were normalized to β － actin.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+ HPost as above;with CYP2J3:transfected CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;##P ＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲P ＜0.05 vs PPOH group;○P ＜0.05 vs CYP2J3 group.圖5 心肌細胞caspase－3蛋白表達的變化

討 論

Zhao等［1］提出缺血后處理的概念后，研究已證實缺血后處理(IPo)有著與缺血預處理相似的心臟保護作用，包括減少心肌梗死面積［2］、減少再灌注心律失常的發(fā)生等。但是缺血后處理的保護作用機制尚不清楚。近年來，內(nèi)源性保護物質(zhì)在缺血后處理中的作用引起關注。我室前期工作證實，CYP2J3/EETs系統(tǒng)上調(diào)可能是缺血后處理獨特的保護機制之一［2］。

CYP2J3作為細胞色素P450表氧化酶(cytochrome P450 epoxygenase)的一個亞型，主要存在于大鼠的肝臟和心臟中。EETs是花生四烯酸經(jīng)CYP450表氧化酶代謝的產(chǎn)物，包括5，6 －EET、8，9 － EET、11，12 － EET、14，15 － EET［10］。近年來CYP2J3/EETs系統(tǒng)對心血管系統(tǒng)的調(diào)控作用引起關注。我室前期通過在體及離體實驗證明，缺血后處理增加心臟CYP2J3表達及11，12－EET水平，可能是拮抗心臟再灌注損傷的信號轉(zhuǎn)導途徑之一［2、5］。IPo導致的 CYP2J3/EET 系統(tǒng)上調(diào)參與心肌保護的機制尚不清楚。鑒于IPo抑制心肌細胞凋亡，且EETs也可抑制細胞凋亡［6］，IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)，進而抑制心肌細胞凋亡而保護心肌的問題值得探討。

Figure 6.The alterations of caspase－3 activity in cardiomyocytes.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.*P＜0.05 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲▲P ＜0.01 vs empty vector group;○○P ＜ 0.01 vs PPOH group.圖6 心肌細胞內(nèi)caspase－3蛋白活性的變化

PPOH是細胞色素P450表氧化酶的特異抑制劑［11］，因為它含有的苯環(huán)基團可以和表氧化酶緊密結(jié)合，除了這個苯環(huán)以外PPOH化學結(jié)構(gòu)含有末端乙炔基團，正是這個基團可以導致表氧化酶自殺式的抑制［12］，實驗證明PPOH末端的乙炔基團不僅可以使細胞色素P450表氧化酶血紅素基團烷化，也可以使表氧化酶的表達下降［11］。這些特點使PPOH能抑制CYP2J的表達及活性，成為CYP2J的特異抑制劑。心肌中CYP450亞型主要是2J2(CYP2J2，人心臟為主)和2J3(CYP2J3，大鼠心臟為主)。所以本實驗選擇PPOH作為CYP2J3的抑制劑來干預CYP2J3/EET系統(tǒng)。

本實驗觀察到H/R組心肌細胞存活率低于對照組(P＜0.01)，提示缺氧/復氧可導致心肌細胞損傷，HPost組心肌細胞存活率低于缺氧/復氧組(P＜0.01)，提示HPost組可以拮抗缺氧/復氧損傷，而對缺血心肌起保護作用，與他人實驗結(jié)果一致［1，2，5］。我們對其機制進行研究，發(fā)現(xiàn) H/R 組心肌細胞培養(yǎng)液中11，12－EET濃度比CON組下降(P＜0.01)，而缺氧后處理組11，12－EET濃度高于缺氧/復氧組(P＜0.01)，在細胞水平上證明缺氧后處理有可能通過內(nèi)源性11，12－EET的上調(diào)而對心肌有保護作用，這與本室在體及離體實驗結(jié)果一致［2，5］。進而我們對心肌細胞進行 CYP2J3外源基因轉(zhuǎn)染，結(jié)果提示基因轉(zhuǎn)染組細胞存活率高于HPost組(P＜0.01)，同時11，12 － EET濃度也高于HPost組(P＜0.01)，提示轉(zhuǎn)染的 CYP2J3基因進行表達，通過分解花生四烯酸，使11，12－EET濃度增加，從而保護心肌細胞。綜上所述提示缺氧后處理有可能是通過提高內(nèi)源性CYP2J3的表達，進而分解花生四烯酸，提高11，12－EET濃度，從而對心肌起保護作用。

在PPOH抑制劑組心肌細胞存活率和11，12－EET濃度相比缺氧后處理組明顯降低(P＜0.01)，提示心肌細胞內(nèi)源性CYP2J3被抑制后，導致11，12－EET濃度下降，減弱了EET對心肌的保護作用。從反面進一步證明了缺血后處理組有可能是通過提高內(nèi)源性CYP2J3的表達，進而提高11，12－EET濃度而對心肌起保護作用。

研究認為，心肌細胞凋亡是多種因素引起的心肌細胞死亡的主要機制［13］。Caspases蛋白的激活是心肌細胞凋亡的一個關鍵現(xiàn)象［14］。其中caspase－3是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必經(jīng)之路，是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，也是細胞凋亡的主要效應因子和最重要的執(zhí)行者［15－17］。心肌缺血/再灌注促進凋亡蛋白caspase－3激活，導致的心肌細胞凋亡可能是缺血/再灌損傷的早期病理改變［18，19］。鑒于 IPo 抑制心肌細胞凋亡［1］，且 EETs也可抑制細胞凋亡［6］，IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)，進而抑制心肌細胞凋亡而保護缺血/再灌心肌?本實驗中H/R組caspase－3蛋白表達(P＜0.05)及活性(P＜0.01)均高于對照組，細胞存活率低于對照組(P＜0.01)，表明缺氧/復氧損傷可導致細胞凋亡，與其它實驗室的實驗結(jié)果一致［20］。HPost組 caspase－3蛋白表達及活性均低于H/R組(P＜0.01)，提示缺氧后處理可以拮抗缺氧/復氧損傷導致的caspase－3蛋白表達增加而抑制細胞凋亡。CYP2J3轉(zhuǎn)染組caspase－3蛋白表達及活性均低于H/R組(P＜0.01)，且轉(zhuǎn)染CYP2J3組心肌細胞存活率也高于H/R組(P＜0.01)，表明CYP2J3高表達可能通過降低caspase－3蛋白表達、降低caspase－3蛋白活性來抑制細胞凋亡，從而對心肌細胞起保護作用。PPOH抑制劑組caspase－3蛋白表達及活性均高于HPost(P＜0.01)，從反向進一步證明了心肌細胞內(nèi)源性CYP2J3被抑制后，減弱了 CYP2J3/EET系統(tǒng)對caspase－3蛋白表達及活性的抑制，促進了心肌細胞的凋亡。

綜上所述，缺氧后處理有可能通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)，來降低caspase－3蛋白的表達及其活性從而抑制心肌細胞凋亡，達到心肌細胞保護作用。鑒于細胞凋亡分線粒體途徑和死亡受體途徑2條途徑，IPo導致的CYP2J3/EET系統(tǒng)上調(diào)究竟通過哪條途徑來抑制細胞凋亡從而發(fā)揮心肌保護作用，值得進一步探討。

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