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        缺氧后處理中CYP2J3/EETs系統(tǒng)對心肌凋亡的影響*

        2011-01-30 03:57:50趙艷芝張冬梅于剛剛曾翔俊王紅霞蘆玲巧張立克王巖梅
        中國病理生理雜志 2011年6期
        關鍵詞:氧化酶后處理培養(yǎng)液

        趙艷芝, 張冬梅, 于剛剛, 曾翔俊, 王紅霞, 蘆玲巧, 張立克, 王巖梅△

        (1首都醫(yī)科大學燕京醫(yī)學院生理與病理生理教研室,北京101300;2首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理教研室,北京100069)

        隨著抗缺血/再灌注損傷(ischemic/reperfusion,I/R)心肌自身保護研究的不斷深入,近年來提出了缺血后處理(ischemic postconditioning,IPo)的概念[1]。大量研究證實缺血后處理具有縮小心肌梗死范圍[2]、減輕內(nèi)皮功能損傷、抗再灌注心律失常、改善心肌代謝及收縮和舒張功能、減輕超微結(jié)構(gòu)的破壞等心肌保護作用[3],減輕細胞凋亡[4]。缺血后處理對心臟再灌注的干預發(fā)生在缺血后,比缺血預處理(ischemic preconditioning,IPc)有明顯的臨床應用優(yōu)勢,故后處理越來越受到醫(yī)學界的廣泛關注。但后處理通過怎樣的機制減輕缺血/再灌注損傷?通過哪種細胞信號轉(zhuǎn)導方式發(fā)揮保護作用?尚不明了。通過在體及離體實驗我室前期工作已證明缺血后處理與細胞色素P450表氧化酶2J3/環(huán)氧二十碳三烯酸系統(tǒng)(cytochrome P450 2J3/epoxyeicosatrienoic acids,CYP2J3/EETs)上調(diào)密切相關[2,5]。鑒于 11,12 -EET具有抑制內(nèi)皮細胞凋亡作用[6],IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng),進而抑制心肌細胞凋亡而保護心肌?值得探討。本工作通過觀察干預內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)對缺氧后處理(hypoxia postconditioning,HPost)心肌細胞凋亡蛋白的影響,了解缺氧后處理上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng)后發(fā)揮心臟保護的可能作用途徑。

        材料和方法

        1 材料

        1.1 主要試劑 胰蛋白酶(Hyclone)、膠原酶Ⅰ、Ⅱ(Sigma)、絲裂霉素 C(Roche)、DMEM(Hyclone);環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)純品及空白對照(Sigma)、無水乙腈(Fisher Scientifid)、甲酸(Sigma-Aldrich Chemic GmbH,Riedstr)、N,N -diisopropylethy lamine(Sigam)、固相提取柱(Waster Corporation);caspase-3活性檢測試劑盒(Roche)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天試劑公司)、caspase-3抗體(Santa Cruz)、Western blotting發(fā)光試劑盒(Pierce);DMSO(Sigma);細胞色素P450表氧化酶抑制劑6-(2-炔丙基氧苯基)己酸[6-(2-propargyloxyphenyl)hexanoic acid,PPOH](Sigma);pcDNA3.12-CYP2J3質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建。

        1.2 主要儀器 超速低溫離心機(Sigma)、細胞培養(yǎng)箱(Revco)、酶標儀(Labsystems)、低溫冰箱(Sanyo)。

        1.3 動物 Wistar乳鼠(12-24 h)由首都醫(yī)科大學動物部提供。

        2 方法

        2.1 心肌細胞原代培養(yǎng)及缺氧/復氧(H/R)模型復制 取Wistar乳鼠(12-24 h)心臟做原代心肌細胞培養(yǎng)[7]。碘酒及乙醇消毒乳鼠胸腹部,開胸取其心臟的心室部分放入含PBS的燒杯內(nèi)沖洗2次,洗凈血液后剪碎心臟成1 mm×1 mm ×1 mm,各加5 mL 1.25 g/L胰酶、1 g/L膠原酶Ⅰ、0.5 g/L膠原酶Ⅱ,37℃水浴消化(加轉(zhuǎn)子)4 min,首次消化液去掉,后5次消化液收集,按1∶1混合20%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含青-鏈霉素100 mg/L)終止消化。用80目篩網(wǎng)過濾1次,配平后1 000 r/min離心10 min棄去上清,加完全培養(yǎng)基至24 mL,吹打均勻,放入1個培養(yǎng)瓶中,加入絲裂霉素C(2 kg/L)抑制成纖維細胞增殖,20 min、37℃培養(yǎng),差速貼壁去掉成纖維細胞。免疫組化方法α-action染色鑒定心肌細胞。

        將細胞放入自制的缺氧罐內(nèi),通入混合氣體(O22%,CO25%,N293%)3 h后再將細胞取出,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中復氧2 h。

        2.2 實驗分組 (1)對照組(control):細胞用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h,不經(jīng)任何處理,繼續(xù)培養(yǎng)5 h;(2)缺氧/復氧組(H/R):按上述方法進行缺氧復氧處理;(3)缺氧后處理組(HPost):心肌細胞缺氧3 h后,采用缺氧罐內(nèi)5 min、復氧5 min重復3次的方法進行后處理,再繼續(xù)復氧85 min;(4)空質(zhì)粒組:按照 2 μg pcDNA3.12 質(zhì)粒/1×105個細胞進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后處理同HPost組;(5)CYP2J3 轉(zhuǎn)染組:按照 2 μg pcDNA3.12-CYP2J3質(zhì)粒/1×105個細胞進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后處理同HPost組;(6)DMSO溶劑組:按照3 μL DMSO/L培養(yǎng)液進行抑制,加入DMSO 24 h后處理同HPost組;(7)PPOH組:按照3μL PPOH/L培養(yǎng)液進行抑制,24 h后處理同HPost組。

        3 觀察指標

        3.1 MTT法檢測細胞活力[8]取96孔培養(yǎng)板中各組細胞,每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),小心棄去培養(yǎng)液,每孔加DMSO 150 μL,微量振蕩器上震搖10 min,使結(jié)晶物充分溶解,酶標儀490 nm下測定各孔吸光度值(A)。

        3.2 高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)檢測心肌細胞培養(yǎng)液中11,12-EET濃度[9]對心肌組織進行處理和衍生后上機檢測樣品,流動相:A相0.5%甲酸水溶液,B相0.5%甲酸乙腈溶液,流速1 mL/min,層析條件:前40 min B相濃度由50%增至65%,其后80 min B相濃度由65%增至100%,最后以B相100%維持20 min。

        3.3 心肌細胞caspase-3蛋白含量 提取細胞蛋白,按BCA蛋白定量試劑盒說明書定量蛋白,采用Western blotting方法測定各組細胞caspase-3蛋白表達變化。

        3.4 心肌細胞caspase-3蛋白活性測定 提取心肌細胞蛋白,按Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天試劑公司)說明書定量蛋白,采用caspase-3蛋白活性檢測試劑盒按照說明書測定caspase-3蛋白活性。

        4 統(tǒng)計學處理

        結(jié) 果

        1 原代心肌細胞培養(yǎng)及鑒定

        原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞在光鏡下呈棱型或多角形伸展,中間較厚,逐漸形成細胞簇或細胞單層,可自然搏動,頻率約為50次/min;用抗肌動蛋白αactin的單克隆抗體鑒定心肌細胞呈陽性,陽性率達95%,胞漿呈淡棕色,清晰可見心肌細胞肌絲結(jié)構(gòu),見圖 1、2。

        2 MTT法檢測細胞活力

        H/R組心肌細胞活力明顯低于control組(P<0.01),HPost組心肌細胞活力高于 H/R組(P<0.01),PPOH組心肌細胞活力明顯低于 HPost組(P<0.01),CYP2J3組心肌細胞活力明顯高于HPost組(P<0.01)。PPOH組與DMSO組之間差異顯著(P<0.05),CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P <0.01),見圖3。

        Figure 1.Cultured neonatal rat cardiac myocytes(×200).圖1 培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞

        Figure 2.Identification of cultured neonatal rat cardiac myocytes with immunohistochemical staining using antibody to α-actin(×200).圖2 乳鼠心肌細胞鑒定

        Figure 3.The effects of CYP2J3/EETs system on livability of cardiac myocytes.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs H/R group;△△P <0.01 vs HPost group;▲P<0.05 vs PPOH group;○○P <0.01 vs CYP2J3 group.圖3 CYP2J3/EET系統(tǒng)對心肌細胞活力的影響

        3 大鼠心肌細胞培養(yǎng)液中11,12-EET濃度的變化

        采用HPLC檢測心肌細胞培養(yǎng)液中11,12-EET濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)H/R組心肌細胞培養(yǎng)液中11,12-EET濃度低于對照組(P<0.01),HPost組心肌細胞培養(yǎng)液中11,12-EET濃度明顯高于H/R組(P<0.01),PPOH抑制劑組明顯低于 HPost組(P<0.01),CYP2J3轉(zhuǎn)染組明顯高于 HPost組(P<0.01)。PPOH組與DMSO組之間有顯著差異(P<0.01),CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P<0.01),見圖4。

        4 心肌細胞caspase-3蛋白含量的變化

        H/R組心肌細胞內(nèi)caspase-3蛋白的表達比對照組高(P<0.05),HPost組心肌細胞內(nèi)caspase-3蛋白的表達明顯低于H/R組(P<0.01),CYP2J3轉(zhuǎn)染組蛋白的表達明顯低于 HPost組(P<0.01),PPOH組蛋白的表達高于 HPost組(P<0.01)。PPOH組于 DMSO組之間差異顯著(P<0.01),CYP2J3組與空質(zhì)粒組之間也有顯著差異(P<0.05),見圖 5。

        5 心肌細胞caspase-3蛋白活性

        H/R組心肌細胞內(nèi)caspase-3蛋白活性比對照組高(P<0.01),HPost組心肌細胞內(nèi)caspase-3蛋白活性明顯低于H/R組(P<0.01),空質(zhì)粒組活性明顯高于HPost組(P<0.01),CYP2J3轉(zhuǎn)染組活性明顯低于空質(zhì)粒組(P<0.01),PPOH組活性高于HPost組(P<0.01)。PPOH組于DMSO組之間差異顯著(P <0.01),見圖6。

        Figure 4.The alterations of 11,12 - EET concentration in cardiomyocyte culture medium.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;Empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.**P<0.01 vs control group;##P <0.01 vs H/R group;△△P <0.01 vs HPost group;▲▲P <0.01 vs PPOH group;○○P <0.01 vs CYP2J3 group.圖4 心肌細胞培養(yǎng)液中11,12-EET濃度的變化

        Figure 5.The expression of caspase-3 protein in cardiomyocytes.The caspase-3 protein levels were normalized to β - actin.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+ HPost as above;with CYP2J3:transfected CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=3.*P<0.05 vs control group;##P <0.01 vs H/R group;△△P <0.01 vs HPost group;▲P <0.05 vs PPOH group;○P <0.05 vs CYP2J3 group.圖5 心肌細胞caspase-3蛋白表達的變化

        討 論

        Zhao等[1]提出缺血后處理的概念后,研究已證實缺血后處理(IPo)有著與缺血預處理相似的心臟保護作用,包括減少心肌梗死面積[2]、減少再灌注心律失常的發(fā)生等。但是缺血后處理的保護作用機制尚不清楚。近年來,內(nèi)源性保護物質(zhì)在缺血后處理中的作用引起關注。我室前期工作證實,CYP2J3/EETs系統(tǒng)上調(diào)可能是缺血后處理獨特的保護機制之一[2]。

        CYP2J3作為細胞色素P450表氧化酶(cytochrome P450 epoxygenase)的一個亞型,主要存在于大鼠的肝臟和心臟中。EETs是花生四烯酸經(jīng)CYP450表氧化酶代謝的產(chǎn)物,包括5,6 -EET、8,9 - EET、11,12 - EET、14,15 - EET[10]。近年來CYP2J3/EETs系統(tǒng)對心血管系統(tǒng)的調(diào)控作用引起關注。我室前期通過在體及離體實驗證明,缺血后處理增加心臟CYP2J3表達及11,12-EET水平,可能是拮抗心臟再灌注損傷的信號轉(zhuǎn)導途徑之一[2、5]。IPo導致的 CYP2J3/EET 系統(tǒng)上調(diào)參與心肌保護的機制尚不清楚。鑒于IPo抑制心肌細胞凋亡,且EETs也可抑制細胞凋亡[6],IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng),進而抑制心肌細胞凋亡而保護心肌的問題值得探討。

        Figure 6.The alterations of caspase-3 activity in cardiomyocytes.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.*P<0.05 vs control group;##P<0.01 vs H/R group;△△P <0.01 vs HPost group;▲▲P <0.01 vs empty vector group;○○P < 0.01 vs PPOH group.圖6 心肌細胞內(nèi)caspase-3蛋白活性的變化

        PPOH是細胞色素P450表氧化酶的特異抑制劑[11],因為它含有的苯環(huán)基團可以和表氧化酶緊密結(jié)合,除了這個苯環(huán)以外PPOH化學結(jié)構(gòu)含有末端乙炔基團,正是這個基團可以導致表氧化酶自殺式的抑制[12],實驗證明PPOH末端的乙炔基團不僅可以使細胞色素P450表氧化酶血紅素基團烷化,也可以使表氧化酶的表達下降[11]。這些特點使PPOH能抑制CYP2J的表達及活性,成為CYP2J的特異抑制劑。心肌中CYP450亞型主要是2J2(CYP2J2,人心臟為主)和2J3(CYP2J3,大鼠心臟為主)。所以本實驗選擇PPOH作為CYP2J3的抑制劑來干預CYP2J3/EET系統(tǒng)。

        本實驗觀察到H/R組心肌細胞存活率低于對照組(P<0.01),提示缺氧/復氧可導致心肌細胞損傷,HPost組心肌細胞存活率低于缺氧/復氧組(P<0.01),提示HPost組可以拮抗缺氧/復氧損傷,而對缺血心肌起保護作用,與他人實驗結(jié)果一致[1,2,5]。我們對其機制進行研究,發(fā)現(xiàn) H/R 組心肌細胞培養(yǎng)液中11,12-EET濃度比CON組下降(P<0.01),而缺氧后處理組11,12-EET濃度高于缺氧/復氧組(P<0.01),在細胞水平上證明缺氧后處理有可能通過內(nèi)源性11,12-EET的上調(diào)而對心肌有保護作用,這與本室在體及離體實驗結(jié)果一致[2,5]。進而我們對心肌細胞進行 CYP2J3外源基因轉(zhuǎn)染,結(jié)果提示基因轉(zhuǎn)染組細胞存活率高于HPost組(P<0.01),同時11,12 - EET濃度也高于HPost組(P<0.01),提示轉(zhuǎn)染的 CYP2J3基因進行表達,通過分解花生四烯酸,使11,12-EET濃度增加,從而保護心肌細胞。綜上所述提示缺氧后處理有可能是通過提高內(nèi)源性CYP2J3的表達,進而分解花生四烯酸,提高11,12-EET濃度,從而對心肌起保護作用。

        在PPOH抑制劑組心肌細胞存活率和11,12-EET濃度相比缺氧后處理組明顯降低(P<0.01),提示心肌細胞內(nèi)源性CYP2J3被抑制后,導致11,12-EET濃度下降,減弱了EET對心肌的保護作用。從反面進一步證明了缺血后處理組有可能是通過提高內(nèi)源性CYP2J3的表達,進而提高11,12-EET濃度而對心肌起保護作用。

        研究認為,心肌細胞凋亡是多種因素引起的心肌細胞死亡的主要機制[13]。Caspases蛋白的激活是心肌細胞凋亡的一個關鍵現(xiàn)象[14]。其中caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必經(jīng)之路,是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶,也是細胞凋亡的主要效應因子和最重要的執(zhí)行者[15-17]。心肌缺血/再灌注促進凋亡蛋白caspase-3激活,導致的心肌細胞凋亡可能是缺血/再灌損傷的早期病理改變[18,19]。鑒于 IPo 抑制心肌細胞凋亡[1],且 EETs也可抑制細胞凋亡[6],IPo是否通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng),進而抑制心肌細胞凋亡而保護缺血/再灌心肌?本實驗中H/R組caspase-3蛋白表達(P<0.05)及活性(P<0.01)均高于對照組,細胞存活率低于對照組(P<0.01),表明缺氧/復氧損傷可導致細胞凋亡,與其它實驗室的實驗結(jié)果一致[20]。HPost組 caspase-3蛋白表達及活性均低于H/R組(P<0.01),提示缺氧后處理可以拮抗缺氧/復氧損傷導致的caspase-3蛋白表達增加而抑制細胞凋亡。CYP2J3轉(zhuǎn)染組caspase-3蛋白表達及活性均低于H/R組(P<0.01),且轉(zhuǎn)染CYP2J3組心肌細胞存活率也高于H/R組(P<0.01),表明CYP2J3高表達可能通過降低caspase-3蛋白表達、降低caspase-3蛋白活性來抑制細胞凋亡,從而對心肌細胞起保護作用。PPOH抑制劑組caspase-3蛋白表達及活性均高于HPost(P<0.01),從反向進一步證明了心肌細胞內(nèi)源性CYP2J3被抑制后,減弱了 CYP2J3/EET系統(tǒng)對caspase-3蛋白表達及活性的抑制,促進了心肌細胞的凋亡。

        綜上所述,缺氧后處理有可能通過上調(diào)CYP2J3/EETs系統(tǒng),來降低caspase-3蛋白的表達及其活性從而抑制心肌細胞凋亡,達到心肌細胞保護作用。鑒于細胞凋亡分線粒體途徑和死亡受體途徑2條途徑,IPo導致的CYP2J3/EET系統(tǒng)上調(diào)究竟通過哪條途徑來抑制細胞凋亡從而發(fā)揮心肌保護作用,值得進一步探討。

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