廖章萍， 章志玲， 李 娟， 鄒逢琳， 尹淑華， 何 明△

(1南昌大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)與分子治療學(xué)教研室，2江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌330006)

缺血缺氧是心肌病變中極常見的一個(gè)病理過程，盡早恢復(fù)血流是防治的基本措施。然而部分患者或動(dòng)物缺血后再灌注，不僅沒使其功能恢復(fù)，反而導(dǎo)致功能和代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重，即為缺血 －再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)［1］。近來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)與心肌缺血－再灌注損傷密切相關(guān)［2］。心肌細(xì)胞缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的聚集可誘導(dǎo)mPTP開放，引起線粒體膜電位下降甚至崩潰，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的不可逆損傷。大量研究表明缺血再灌注中，如能抑制mPTP 的開放則可有效減輕 IRI［3，4］。因此如何調(diào)節(jié)mPTP的開放與關(guān)閉已成對(duì)抗IRI的主要策略。

mPTP是一個(gè)跨膜多蛋白復(fù)合體孔道，主要由外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage－dependent anion channel，VDAC)、內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶(adenine nucleotide translocase，ANT)、基質(zhì)的親環(huán)素 D(cyclophilin D，CyP－D)，及其它的蛋白如環(huán)孢菌素A(cyclosporin A，CsA)、己糖激酶(hexokinase ，HK)等組成［5］。

其中VDAC是一分子量大約30 kD、在線粒體外膜上含量豐富的蛋白質(zhì)。VDAC能在脂質(zhì)雙分子層中形成一個(gè)大的電壓門控通道，通道開放和關(guān)閉狀態(tài)與線粒體膜電位水平密切相關(guān)。且文獻(xiàn)報(bào)道，過度表達(dá)VDAC能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。VDAC有3個(gè)亞型，分別是VDAC1、VDAC2和VDAC3，其中VDAC1在哺乳動(dòng)物的線粒體膜上表達(dá)最為廣泛［7］。本研究以VDAC1為研究對(duì)象，探討其與mPTP的關(guān)系及在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧(anoxia/reoxygenation，A/R)中的作用，為研究探索心肌細(xì)胞急性損傷時(shí)的分子生物學(xué)機(jī)制，尋找新的藥物作用靶點(diǎn)拓展新的思路。

材料和方法

1 藥品與主要試劑

大鼠H9c2心肌細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RNA干擾質(zhì)粒pSUPER由美國(guó)波士頓大學(xué)羅志軍教授惠贈(zèng);限制性內(nèi)切酶Bgl II、Xho I、Bam HI(NEB);T4DNA連接酶、凝膠回收試劑盒及無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega;Lipofectamine 2000TM脂質(zhì)體購自Invitrogen;VDAC1抗體、β－actin抗體及相應(yīng)Ⅱ抗均購自Santa Cruz;JC－1購自Molecular Probes;總蛋白提取試劑盒購自普利來公司。其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、飽和濕度及37℃條件下培養(yǎng)。

3 VDAC1 shRNA干擾質(zhì)粒下調(diào)VDAC1表達(dá)

3.1 VDAC1 shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù) Gen-Bank找出大鼠 VDAC1 mRNA核苷酸序列 NM_031353，運(yùn)用Oligoengine公司siRNA靶序列設(shè)計(jì)軟件找到3條靶序列，如下:(1)AATGTGAATGATGGGACGG(546);(2)GAAGTGGAACACAGACAAC(218);(3)AGTACAGATGGACCGAGTA(181)。以pSUPER質(zhì)粒為載體，Bgl II、Xho I雙切后，插入帶有黏性末端的VDAC1 shRNA核苷酸序列。

3.2 VDAC1 shRNA干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前1 d，去除培養(yǎng)基中的抗生素和血清，將質(zhì)粒用Lipofectamine 2000TM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9c2中。

3.3 重組質(zhì)粒干擾效率的檢測(cè) 為了更好地提高干擾效率，將重組成功的3個(gè)含VDAC1基因序列特異性堿基的shRNA質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞H9c2中，檢測(cè)H9c2的蛋白表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)分3組，每組重復(fù)8次。(1)正常對(duì)照(control)組:不做任何處理的H9c2細(xì)胞;(2)pSUPER組:將空載質(zhì)粒pSUPER轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞;(3)pSUPER－VDAC1組:將干擾質(zhì)粒pSUPER－VDAC1轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞。

4 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型建立

心肌細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合狀態(tài)時(shí)，對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞換用預(yù)先經(jīng)95%N2和5%CO2混和氣體飽和過的模擬缺氧缺糖溶液(NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO36.0 mmol/L， CaCl21.8 mmol/L， MgSO41.2 mmol/L，HEPES 20 mmol/L，NaCl 98.5 mmol/L，KCl 10.0 mmol/L，pH 6.8，37 ℃)，置于持續(xù) 95%N2－5%CO2平衡的A/R裝置(37℃)中缺氧孵育3 h后，再換用模擬再灌注溶液(NaCl 129.5 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO320 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L ，MgSO41.2 mmol/L，glucose 55 mmol/L，HEPES 20 mmol/L，pH 7.4，37 ℃)于95%O2、5%CO2復(fù)氧孵育2 h。

5 心肌細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)(anoxia preconditioning，APC)模型建立

細(xì)胞更換培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，然后換預(yù)先經(jīng)95%N2和5%CO2混和氣體飽和過的模擬缺氧液，將細(xì)胞置于95%N2－5%CO2持續(xù)通氣的缺氧密閉容器中(37℃)30 min，再換模擬再灌注液，以95%O2和5%CO2混合氣體進(jìn)行復(fù)氧孵育30 min(37℃)，重復(fù)3次。

6 實(shí)驗(yàn)分組

共分5組，每組重復(fù)8次。(1)control組:棄培養(yǎng)液，換用正常Tyrode溶液置于培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣、37℃)孵育3 h后，再換上模擬再灌注溶液置于培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣，37℃)孵育2 h;(2)A/R組:棄培養(yǎng)液，換用模擬缺氧缺糖溶液將培養(yǎng)板置于持續(xù)95%N2、5%CO2平衡的缺氧密閉容器中(37℃)3 h，再換上模擬再灌注液，以95%O2、5%CO2混合氣體進(jìn)行復(fù)氧孵育2 h(37℃);(3)APC組:棄培養(yǎng)液，換用模擬缺氧缺糖液置于培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣，37℃)孵育30 min，再換模擬再灌注液，以95%O2和5%CO2混合氣體進(jìn)行復(fù)氧孵育30 min(37℃)，重復(fù)3次;然后進(jìn)行A/R處理;(4)pSUPER－VDAC1－A/R組:3個(gè)VDAC1 shRNA干擾質(zhì)粒用脂質(zhì)體共同轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9c2中，48 h后處理同A/R組;(5)pSUPER－A/R組:pSUPER空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9c2中，48 h后處理同A/R組。

7 心肌細(xì)胞H9c2 VDAC1蛋白的檢測(cè)

按蛋白提取試劑盒的方法提取H9c2細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后分裝，－20℃保存。取上述細(xì)胞蛋白提取液上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE，15%分離膠)，將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉、洗脫后加入VDAC1抗體(1∶200)或 β －actin抗體(1∶200)，放置4℃過夜，洗膜后以相應(yīng)的Ⅱ抗孵育1 h，再洗膜，加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，置暗室中曝光、顯影、定影膠片。將X光膠片掃描后，在Image Tool醫(yī)學(xué)圖形分析軟件上進(jìn)行分析。將所得VDAC1蛋白帶的綜合密度分別除以β－actin相對(duì)應(yīng)樣本的綜合密度。

8 細(xì)胞存活率檢測(cè)

采取MTT比色法檢測(cè)，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板的H9c2細(xì)胞，接種密度為 104cells/well，每孔液體200 μL。實(shí)驗(yàn)處理后各組每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，孵育4 h;去培養(yǎng)液，然后各組每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，選擇490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值。設(shè)不加細(xì)胞只加孵育液的空白對(duì)照，記錄結(jié)果。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

9 生化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組分別取孵育液200 μL，Beckman生化自動(dòng)分析儀測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸磷酸酶(creatine phosphokinase，CPK)活性。

10 流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位

JC－1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC－1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí)，JC－1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC－1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變可以反映線粒體膜電位的變化。先用0.25%胰酶消化心肌細(xì)胞，細(xì)胞(1×106)以1 000×g離心 5 min，1 mL PBS 重懸細(xì)胞，加入 10 μL 200 μmol/L JC －1(終濃度 2 μmol/L)，37 ℃ 孵育30 min，PBS洗滌 2 次后，500 μL PBS重懸細(xì)胞，立即進(jìn)行流式分析，以加羰基氰氯苯腙(CCCP，終濃度50 μmol/L，37℃孵育 5 min)組為陽性對(duì)照。

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒干擾效率

Western blotting結(jié)果(圖1)顯示，轉(zhuǎn)染了空載質(zhì)粒pSUPER組VDAC1蛋白表達(dá)與正常組相比無明顯改變，而轉(zhuǎn)染了含VDAC1基因序列特異性堿基的shRNA質(zhì)粒的pSUPER－VDAC1組VDAC1蛋白表達(dá)則顯著下降，較正常組降低了66%。此結(jié)果說明重組RNA干擾質(zhì)粒能有效下降VDAC1的表達(dá)

Figure 1.Western blotting analysis of VDAC1 in H9c2 cells transfect with RNA interference recombinant vector.±s.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs pSUPER group.圖1 Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染RNA干擾重組質(zhì)粒后H9c2細(xì)胞VDAC1蛋白表達(dá)的結(jié)果

2 不同處理組對(duì)VDAC1表達(dá)的影響

以各組β－actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的H9c2細(xì)胞 VDAC1的蛋白表達(dá)量，control組、A/R組、APC 組分別為 0.52 ±0.05、1.11 ±0.10、0.60 ±0.06。說明經(jīng)A/R處理后，VDAC表達(dá)明顯增加，而APC則能抑制其上調(diào)，見圖2。

3 VDAC1低表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后LDH、CPK的影響

如圖3所示，與control組比，A/R組細(xì)胞懸液中LDH和CPK活性分別增加至1.9倍和2倍;APC組細(xì)胞懸液LDH及CPK活性則顯著降低;與APC組相似，pSUPER－VDAC1－A/R組，VDAC1表達(dá)下調(diào)后再經(jīng)A/R處理，LDH及CPK活性亦明顯下降，但pSUPER－A/R組則與A/R組無顯著差異。說明下調(diào)VDAC1表達(dá)能有效對(duì)抗A/R損傷所致的LDH及CPK活性增加。

Figure 2.Effect of various treatments on expression of VDAC1 protein in H9c2 cells.±s.n=8.＊＊P＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs A/R group.圖2 不同處理組對(duì)H9c2細(xì)胞VDAC1蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.Effect of down－regulation of VDAC1 on LDH and CPK activity in H9c2 cells subjected to A/R injury.±s.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs pSUPER －A/R group;##P ＜0.01 vs A/R group.圖3VDAC1低表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后LDH和CPK活性的影響

4 VDAC1低表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果(圖4)顯示，經(jīng)A/R處理后，H9c2細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞存活率較control組降低48.5%;但APC則能防止細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活率較A/R增高;相似地，VDAC1低表達(dá)的pSUPER－VDAC1－A/R組細(xì)胞存活率也較A/R組顯著提高;而pSUPERA/R組與A/R組無顯著差異。說明下調(diào)VDAC1能有效保護(hù)H9c2細(xì)胞，對(duì)抗A/R損傷，提高細(xì)胞存活率。

Figure 4.Effect of down－regulation of VDAC1 on cell viability in H9c2 cells subjected to A/R injury.±s.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs pSUPER －A/R group;##P ＜0.01 vs A/R group.圖4 VDAC1低表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后細(xì)胞存活率的影響

5 VDAC1低表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后線粒體膜電位的影響

本實(shí)驗(yàn)以紅、綠熒光的比值衡量線粒體去極化的比例。如圖5，A/R組紅、綠熒光比值明顯下降，說明H9c2細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低，與control組比有顯著差異，但VDAC1低表達(dá)的pSUPER－VDAC1－A/R組細(xì)胞與APC組細(xì)胞的線粒體膜電位則得到了保護(hù)，防止了膜電位的崩潰;pSUPER－A/R組則與A/R組無顯著差異。這說明下調(diào)VDAC1表達(dá)能有效抑制細(xì)胞線粒體損傷，穩(wěn)定線粒體膜電位。

討 論

心肌缺血再灌注損傷是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞恢復(fù)血液供應(yīng)后產(chǎn)生更為嚴(yán)重的損傷［8］。在缺血缺氧或缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞內(nèi)低氧、缺氧發(fā)生酸中毒，激動(dòng)H+－Na+交換，此時(shí)由于細(xì)胞內(nèi)能量缺失、耗竭導(dǎo)致Na+－K+－ATP酶被抑制，使得心肌細(xì)胞內(nèi)Na+迅速升高，誘發(fā)Na+－Ca2+交換增加，細(xì)胞外Ca2+大量進(jìn)入，通過胞外Ca2+內(nèi)流亦可引起胞內(nèi)Ca2+釋放即Ca2+誘導(dǎo)的Ca2+釋放(calcium －induced calcium release，CICR)機(jī)制，肌漿網(wǎng)中的Ca2+釋放，使得細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量急劇增加，導(dǎo)致Ca2+超載［9］。Ca2+超載是造成缺血再灌注損傷的主要原因之一。

近來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體不僅控制機(jī)體的能量代謝，而且在維持細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡或壞死等過程中起著決定性作用［10］。其功能障礙與mPTP密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為［11］mPTP在誘發(fā)肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+大量釋放導(dǎo)致Ca2+超載方面起了重要的作用，或是具有CICR通道之特征［12］。研究表明［13］:線粒體胞漿中Ca2+的聚集，可使得線粒體膜電位振蕩，誘發(fā)Ca2+外流，后者迅速的被鄰近正常之線粒體攝取并觸發(fā)其mPTP開放，即mCICR;由此誘發(fā)的、被稱為mCICR波的大量線粒體膜電位振蕩，導(dǎo)致線粒體膜內(nèi)外電荷平衡分布被破壞，線粒體膜去極化，膜電位降低或喪失，往往可直接誘發(fā)致死性心率失常。目前認(rèn)為，防止mPTP的開放即為防止缺血再灌注損傷的有效策略。

VDAC是一位于mPTP外膜上的陰離子通道，其控制著離子和代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響一些生理及病理過程［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)過A/R處理后，與正常組細(xì)胞相比，VDAC蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞存活率顯著降低，線粒體膜電位的明顯下降說明mPTP過度開放;而APC處理則能抑制VDAC表達(dá)的上調(diào)，對(duì)抗A/R。進(jìn)一步結(jié)果顯示，通過RNA干擾下調(diào)VDAC蛋白表達(dá)可有效保護(hù)心肌細(xì)胞，維持線粒體膜電位，防止mPTP開放，減輕A/R損傷。以上結(jié)果強(qiáng)烈提示心肌A/R損傷，VDAC對(duì)mPTP的開放和關(guān)閉起重要作用。有資料表明［15］:缺血的心肌組織在再灌注階段，某些離子可以通過VDAC進(jìn)入線粒體，引起mPTP的開放，因?yàn)橥饽さ拿娣e遠(yuǎn)小于內(nèi)膜，顯著的基質(zhì)膨脹和mPTP長(zhǎng)時(shí)間開放能引起嵴伸展，導(dǎo)致外膜破裂和線粒體不可逆損傷;此外，外膜破裂會(huì)導(dǎo)致分布在膜間的前凋亡分子釋放，包括細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等，通過caspases依賴機(jī)制或是AIF依賴機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。新近研究發(fā)現(xiàn)［16］，VDAC通過分子伴侶glucose－regulated protein 75(GRP75)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體偶聯(lián)，在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)及其介導(dǎo)的CICR中發(fā)揮重要作用。

Figure 5.Effect of down－regulation of VDAC1 on mitochondria membrane potential in H9c2 cells subjected to A/R injury.JC－1－exhibited red/green fluorescence was used to analyze mitochondrial potential in H9c2 cells by flow cytometry.The ratio of red－to－green JC－1 fluorescence is dependent only on the membrane potential.JC－1 changes color from red to green as the membrane potential decreases or collapses.±s.n=8.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs pSUPER－A/R group;△△P ＜0.01 vs A/R group.圖5 VDAC1低表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后線粒體膜電位的影響

綜上所述，VDAC1與mPTP的開放關(guān)系密切，下調(diào)VDAC1可有效對(duì)抗A/R損傷引起的mPTP的開放，維持線粒體膜電位，保護(hù)細(xì)胞。

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