張小菊 王 荔 高建英

山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 太原 030001

塞來(lái)昔布對(duì)高脂血癥大鼠腦缺血再灌注后MMP-9和COX-2表達(dá)的影響▲

張小菊 王 荔△高建英

山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 太原 030001

目的觀察塞來(lái)昔布對(duì)高脂血癥(hyperlipidem ia,H L)大鼠腦缺血再灌注損傷后基質(zhì)金屬蛋白酶-9(metalloproteinase-9,MMP-9)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達(dá)的影響。方法健康雄性Wister大鼠 70只隨機(jī)分為 4組：正常假手術(shù)組(S組)10只、正常缺血再灌注組(nIR組)20只、高脂缺血再灌注組(h IR組)20只和高脂缺血再灌注塞來(lái)昔布干預(yù)組(C+hIR組)20只。后3組又分為缺血1 h再灌注12 h、24 h、48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)。采用高脂飲食建立高脂血癥大鼠模型,應(yīng)用線栓法制做大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型。用免疫組化法檢測(cè)腦組織MMP-9、COX-2的表達(dá),氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測(cè)定梗死灶體積。結(jié)果在同一缺血再灌注時(shí)間點(diǎn),與n IR組比較,hIR組、C+h IR組腦組織MMP-9、COX-2表達(dá)明顯增高(P＜0.01),h IR組梗死體積增大具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),C+hIR組梗死體積增大具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與hIR組相比,C+h IR組腦組織MMP-9、COX-2表達(dá)下降、梗死體積減小(P＜0.01),腦缺血再灌注后腦組織中MMP-9、COX-2的表達(dá)有顯著的相關(guān)性(r=0.835)。結(jié)論高脂血癥合并腦缺血再灌注損傷病理過(guò)程中炎癥反應(yīng)起重要作用。塞來(lái)昔布對(duì)高脂腦缺血再灌注大鼠COX-2、MM P-9的過(guò)度表達(dá)產(chǎn)生抑制作用,干預(yù)炎癥反應(yīng)減輕腦缺血再灌注損傷。

高脂血癥;腦缺血再灌注損傷;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;環(huán)氧化物酶-2;塞來(lái)昔布

在腦缺血的病理生理過(guò)程中,腦缺血后的炎癥反應(yīng)日益受以重視,最初腦損害是由于血供障礙缺氧造成的,隨后由于缺血缺氧所繼發(fā)的系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)所引發(fā)。炎癥在這眾多級(jí)聯(lián)損害中起重要作用,尤其再灌注后炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇腦缺血損傷,阻斷再灌注后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是改善缺血后繼發(fā)性腦損傷的理想策略。

臨床上有相當(dāng)比例的腦梗死患者合并有高血脂癥,高膽固醇血癥已是腦卒中的危險(xiǎn)因素,本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食制作高脂血癥大鼠模型,從腦缺血再灌注損傷發(fā)生后的細(xì)胞炎性損傷入手,利用塞來(lái)昔布干預(yù)高脂血癥大鼠腦缺血再灌注模型,探索其作用機(jī)制,擬為尋求臨床上的腦保護(hù)治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)分組 健康雄性Wistar大鼠70只,體質(zhì)量(110±10)g,4～5周齡(山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供)。實(shí)驗(yàn)分組：先隨機(jī)分為2組：普通飼料喂養(yǎng)組30只及高脂飼料喂養(yǎng)組40只。以上大鼠同期喂養(yǎng)8周后,普通飼料喂養(yǎng)組隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組(S組)10只和正常缺血再灌注組(n IR組)20只;高脂飼料喂養(yǎng)組隨機(jī)分為2組：高脂缺血再灌注組(h IR組)20只和高脂缺血再灌注缺血塞來(lái)昔布干預(yù)組(C+h IR組)20只。后3組并隨機(jī)分為3個(gè)亞組：分別于缺血1 h再灌注后 12 h、24 h、48 h處死,各亞組分別有 5、10、5只大鼠。假手術(shù)組僅取24 h時(shí)間點(diǎn)作為對(duì)照。高脂缺血再灌注塞來(lái)昔布干預(yù)組缺血1 h后給予生理鹽水新鮮配置的塞來(lái)昔布懸液25 mg/kg灌胃(其他各組在缺血后1 h后給予等量生理鹽水灌胃)。各亞組及假手術(shù)組取5只行免疫組化染色,僅取24 h時(shí)間點(diǎn)5只大鼠行 TTC染色。

1.2 動(dòng)物模型制備 首先建立高脂血癥模型：給予高脂飼料喂養(yǎng)。連續(xù)喂養(yǎng)大鼠8周,斷尾取血2m L,用于檢測(cè)血脂四項(xiàng)。血脂測(cè)定與同期普通飼料喂養(yǎng)大鼠的血脂差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。腦缺血再灌注模型制備：采用改良的Longa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(m idd le cerebral artery occlusion,MCAO)模型,假手術(shù)組操作過(guò)程同上,但栓線插入深度＜10 mm。取神經(jīng)功能缺損評(píng)分為1～3分的大鼠作為研究對(duì)象。

1.3 腦梗死體積比測(cè)定 各實(shí)驗(yàn)組各取5只成膜大鼠再灌注24 h斷頭取腦。將鼠腦置于-20℃冰箱20 m in使之發(fā)硬,再將其切成5等份冠狀位切片,置于2%TTC溶液中,37℃水溶,10%甲醛液固定。通過(guò)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行切片梗死體積及全腦梗死體積計(jì)算,各樣本以梗死體積/全腦體積比作統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.4 免疫組化測(cè)定 灌注后開顱取腦制成蠟塊,連續(xù)切片,光鏡下觀察胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。每只大鼠取4張連續(xù)切片,在400倍光鏡下每張組織切片在缺血側(cè)隨機(jī)選4個(gè)不重復(fù)視野,采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每只動(dòng)物MMP-9、COX-2陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值取平均值作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 塞來(lái)昔布對(duì)局灶性腦缺血大鼠梗死灶體積的影響 假手術(shù)組大鼠腦組織無(wú)梗死灶,呈均勻一致的紅色。余各組大鼠腦組織均顯示不同范圍的蒼白色梗死灶,n IR組、h IR組梗死體積比分別為(20.68±1.09)和(32.13±1.22)%,與 nIR組相比,h IR組腦梗死灶體積增大(P＜0.01);C+h IR組梗死體積比為(24.03±1.35)%,與h IR組相比梗死體積減小(P＜0.01),與 nIR組相比梗死體積增大(P＜0.05)。

2.2 再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織中M MP-9的表達(dá) 見表1、圖1A～圖1C。免疫組化顯示,S組腦組織中可見少量淡染的棕黃色MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞,散在分布于大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)域。再灌注12 h,缺血側(cè)腦組織MM P-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增多,顏色增強(qiáng)。再灌注24 h MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)達(dá)高峰,48 h表達(dá)下降,但在不同時(shí)相MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)大小不一致,可在缺血梗死區(qū),梗死灶周圍出現(xiàn),在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中見到。同一時(shí)間點(diǎn),與n IR組比較,h IR組、C+h IR組增高(P＜0.01);C+hIR組較h IR組降低(P＜0.01)。

2.3 再灌注后不同時(shí)間各組大鼠腦組織中COX-2的表達(dá)

見表2、圖 1D～圖 1F。COX-2陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。S組COX-2陽(yáng)性神經(jīng)元散在于大腦皮質(zhì),海馬區(qū),數(shù)量極少,再灌注12 h組在缺血側(cè)額頂葉皮層可見大量棕黃色淡染陽(yáng)性細(xì)胞。再灌注24 h,缺血邊緣區(qū)相當(dāng)于缺血半暗帶區(qū)可見大量COX-2陽(yáng)性表達(dá),顏色增強(qiáng),COX-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)達(dá)高峰。48h表達(dá)下降,與n IR組比較,h IR組、C+h IR組表達(dá)明顯增高(P＜0.01),C+h IR組較hIR組明顯降低(P＜0.01)。

表1 缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)各組MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度值 (±s)

表1 缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)各組MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度值 (±s)

與nIR組比較,▲P＜0.01;表示與 h IR組比較,★P＜0.01;S組與其余各組比較,■P＜0.01;-表示未做檢測(cè)

組別 n 再灌注12 h組再灌注24 h組再灌注48 h組S 組 5 - 0.188±0.021■ -nIR 組 5 0.304±0.019 0.341±0.022 0.282±0.024 hIR 組 5 0.357±0.031▲ 0.424±0.02▲ 0.339±0.014▲C+h IR 組 5 0.323±0.152▲★ 0.365±0.021▲★ 0.302±0.013▲★

表2 缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)各組COX-2陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度值(±s)

表2 缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)各組COX-2陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度值(±s)

與n IR組比較,▲P＜0.01;與 h IR組比較,★P＜0.01;S組與其余各組比較,■P＜0.01;-表示未做檢測(cè)

組別 n 12 h組 24 h組 48 h組S 組 5 - 0.174±0.023■ -nIR 組 5 0.233±0.013 0.299±0.025 0.223±0.011 hIR 組 5 0.289±0.010▲ 0.365±0.034▲ 0.269±0.02▲C+h IR 組 5 0.254±0.017▲★ 0.323±0.021▲★ 0.248±0.014▲★

2.4 腦缺血再灌注后腦組織 MMP-9與COX-2表達(dá)相關(guān)性分析,兩者表達(dá)具有顯著正相關(guān)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.835,P＜0.01)。

3 討論

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶系(MMPs)中的一員,是一種依賴鋅離子的金屬蛋白酶,主要功能是降解和重塑ECM。缺血腦組織受到炎癥刺激使星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌MMP-9。腦缺血后MMP-9可降解基底膜的主要成分,如Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白,導(dǎo)致血管完整性破壞,血腦屏障破壞,腦水腫形成以及在繼發(fā)性腦損傷過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[1]。

COX-2是花生四烯酸代謝過(guò)程中最重要的限速酶。在大多數(shù)正常組織內(nèi)檢測(cè)不到,可以被生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或其他的炎癥介質(zhì)所誘導(dǎo)。腦組織在正常情況下可少量表達(dá)COX-2,Yokota等[2]對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型的研究顯示,缺血后30m in,COX-2m RNA在半暗帶和未受損的扣帶回表達(dá)增強(qiáng),24 h時(shí)與缺血中心區(qū)比較,仍維持較高水平。多年的研究證實(shí),環(huán)氧化酶激活是腦缺血性腦損傷過(guò)程中觸發(fā)和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一,COX-2是炎癥所致細(xì)胞毒性的關(guān)鍵因子。

該研究結(jié)果顯示,腦缺血再灌注后,缺血腦組織中炎性因子MMP-9和COX-2表達(dá)水平明顯增高,在缺血再灌注24 h表達(dá)高峰,與以往研究結(jié)果相一致[3-4],且可以證實(shí)腦缺血再灌注大鼠腦組織存在明顯的炎性反應(yīng)。hIR組與n IR組比較,兩者表達(dá)水平明顯升高,梗死體積增大。表明高脂血癥大鼠發(fā)生腦缺血再灌注后,炎癥反應(yīng)加重,從而加重腦缺血再灌注后損傷。研究表明,動(dòng)脈粥樣斑塊中COX-2能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞合成與釋放MMPs,COX-2及前列腺素產(chǎn)物能活化MMPs[5]。孫春雷[6]等研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中COX-2和MMP-9蛋白高表達(dá),且兩者具有顯著正相關(guān)性,過(guò)度表達(dá)的COX-2,促進(jìn)了PGE2合成,從而刺激MM P-9分泌或者可能直接誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)上調(diào)。該研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組腦組織COX-2與MM P-9表達(dá)在時(shí)間上是一致的,兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān)性。從而推測(cè)腦缺血再灌注后COX-2表達(dá)增加及其產(chǎn)物促使MMP-9表達(dá)增加。

減少或抑制COX-2和MMP-9過(guò)度產(chǎn)生可能是防治腦缺血再灌注損傷的有效途徑,近年的研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腦缺血再灌注中,尼美舒利還能夠抑制炎性因子MMP-9、MMP-2的表達(dá)[7],減少梗死形成,改善神經(jīng)功能,減輕血腦屏障損壞及水腫,減少白細(xì)胞浸潤(rùn)以及具有持久的神經(jīng)保護(hù)作用[8]。在ACS患者中采用選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布干預(yù)單核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布能抑制單核細(xì)胞分泌IL-6和MMP-9[9]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,C+hIR組COX-2和MM P-9表達(dá)較hIR組明顯下降,梗死體積減小。從而推測(cè)塞來(lái)昔布作為選擇性COX-2抑制劑,可通過(guò)抑制高脂腦缺血再灌注損傷中COX-2的表達(dá),進(jìn)一步抑制MMP-9表達(dá),減輕炎癥反應(yīng),減小梗死體積,減輕腦缺血再灌注損傷。盡管高脂腦缺血再灌注模型給予塞來(lái)昔布干預(yù),但與n IR組相比梗死體積較大,MMP-9、COX-2表達(dá)增高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明在高脂血癥的基礎(chǔ)上發(fā)生腦缺血再灌注后,MM P-9、COX-2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能在高脂腦缺血再灌注中起重要的作用,其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

總之,塞來(lái)昔布與其他傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥相比,塞來(lái)昔布具有特異性抑制COX-2表達(dá)的特點(diǎn),而不影響COX-1活性及其正常的生理功能,塞來(lái)昔布的不良反應(yīng)最小,在塞來(lái)昔布使用普通劑量的研究中并未出現(xiàn)心血管事件發(fā)生增加[10],并有研究顯示塞來(lái)昔布能保護(hù)血管內(nèi)皮功能[11],故在臨床有著引人注目的應(yīng)用前景。是否可用于腦梗死的治療仍需大量的動(dòng)物及臨床實(shí)踐證明。

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山西省高校核科技研究開發(fā)項(xiàng)目,編號(hào)：20091181△

王荔,山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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A

1673-5110(2011)07-0026-04

(收稿2011-01-21)