蔡 郁，梁文革，劉新顏

北京老年醫(yī)院藥劑科，北京 100095

本品為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根[1]。白芍始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。古人用芍藥“主治結(jié)實(shí)而拘攣也。旁治腹痛、頭痛、身體不仁、疼痛滿腹、咳逆下利、腫膿”。性苦，微寒；歸肝經(jīng)。有清熱涼血，散瘀止痛之功效[2]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明白芍的主要藥理活性成分為芍藥苷為代表的芍藥總苷。主要藥理作用為芍藥苷具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，能延長(zhǎng)環(huán)己巴比妥鈉對(duì)小鼠的睡眠時(shí)間，對(duì)五甲烯四氮唑所致的驚厥有拮抗作用；芍藥苷能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血流量，對(duì)抗急性心肌缺血，抑制血小板聚集及降低血壓等作用；此外芍藥苷還具有抗炎、抗?jié)?、抗過(guò)敏、解熱、解痙等作用[3-4]。對(duì)于指導(dǎo)各種制劑的處方設(shè)計(jì)，研究藥物的腸道吸收機(jī)制及部位，尤其是設(shè)計(jì)緩控釋制劑的處方具有重要意義。離體法、在體法和體內(nèi)法等是研究藥物腸吸收動(dòng)力學(xué)的方法[5-11]。離體法明顯優(yōu)于在體法，因?yàn)闆](méi)有損壞研究部位的淋巴和血液循環(huán)系統(tǒng)。其中單向灌流模型被廣泛應(yīng)用，因有吸收速率穩(wěn)定、與人體有良好的相關(guān)性的優(yōu)點(diǎn)[7-11]。因此本文采用單向灌流重量法對(duì)白芍提取物中芍藥苷的腸吸收動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，以期為芍藥苷口服緩控釋給藥制劑的現(xiàn)代化研究提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

LC-10ATVP型高效液相色譜儀（日本島津公司），SPDM20A型檢測(cè)器（日本島津公司）；BT00-100M型蠕動(dòng)泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。芍藥苷對(duì)照品（Paeoniflorin，批號(hào)：36-200016，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；白芍提取物（徐州弘康科技有限公司）；烏拉坦（進(jìn)口分裝）；乙腈（色譜純，山東禹王試劑公司）；其他試劑均為分析純。Krebs-Ringer緩沖液（K氏液，pH=6.8）：葡萄糖 1.49 g、氯化鉀 0.35 g、氯化鎂 0.02 g、氯化鈣 0.36 g、氯化鈉 7.8 g、碳酸氫鈉 1.36 g、磷酸二氫鈉0.02 g加水定容至1 L。

1.2 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用 Wistar健康大鼠，雄性，體重（250±20）g，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 測(cè)定方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷HPLC的測(cè)定

色譜柱：CEC C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）； 保護(hù)柱：CEC C18柱（4.6 mm×10.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-磷酸二氫鈉水溶液（0.1 mol/L）（體積比為 20∶80）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 芍藥苷方法學(xué)驗(yàn)證

精密稱(chēng)取對(duì)照品芍藥苷1.00 mg，放置在10 ml容量瓶中，芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液：以空白灌流液溶解并定容，濃度為100.0 mg/L，芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：以空白灌流液配成芍藥苷濃度分別為 2.0、5.0、8.0、10.0、20.0、50.0 mg/L。 使用 0.45 μm濾膜，分別取上述芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液20 μl進(jìn)樣。以峰面積A為橫坐標(biāo)，濃度C（mg/L）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：C=6.34×10-5A-1 287.4（r=0.999 9）。 2.0～50.0 mg/L線性關(guān)系良好。 回收率：5.0、10.0、50.0 mg/L 濃度下的回收率均大于 99%（n=5）；精密度：日內(nèi)、日間RSD均小于3%（n=5）。

2.3 穩(wěn)定性的考察

3份9.80 mg/L的芍藥苷溶液用空白腸灌流液配制，在37℃水浴中孵育 6 h，取樣時(shí)間分別為 0、1、2、3、4、6 h，樣品注入液相色譜儀進(jìn)行分析，記錄峰面積，得RSD=1.04%（n=6），表明芍藥苷在灌流液中6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 白芍提取物中芍藥苷含量的測(cè)定

取適量白芍提取物用水溶解，溶液用HPLC測(cè)定峰面積計(jì)算芍藥苷含量，結(jié)果為36.5%（n=5）為芍藥苷。

3 大鼠在體腸單向灌流法

3.1 實(shí)驗(yàn)步驟

為了消除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中管路對(duì)藥物的吸附作用，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前用供試液將管道飽和至出液口藥液濃度與供試液濃度相等為止。大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食一夜（自由飲水），腹腔注射烏拉坦溶液（20%，0.5 ml/100 g），固定于恒溫手術(shù)臺(tái)上。沿腹中線剪開(kāi)腹部（3～4 cm），對(duì)考察的取約10 cm于兩端剪切后插直徑為0.3 cm的玻璃管，用預(yù)熱至37℃的生理鹽水對(duì)所取腸道進(jìn)行沖洗，清除其內(nèi)容物，再用空氣將生理鹽水排凈。將腸管兩端的玻璃管與蠕動(dòng)泵的膠管連接，形成回路。開(kāi)動(dòng)蠕動(dòng)泵，以流速0.2 ml/min進(jìn)行灌流，用已知重量的小瓶在出口處每隔15 min收集一次，作為一個(gè)取樣點(diǎn)，同時(shí)用下一個(gè)已知重量的小瓶替換，計(jì)算收集前后小瓶重量稱(chēng)量差，同時(shí)測(cè)定收集液中藥物濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠并剪下被灌流的腸段，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑。

3.2 腸道吸收水分的校正

在灌流藥液之前，用空白K氏液灌流個(gè)腸段，以進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并對(duì)水分對(duì)灌流液重量影響進(jìn)行校正。

4 數(shù)據(jù)分析

4.1 藥物吸收速率常數(shù)（Ka）的計(jì)算

4.2 藥物表觀吸收系數(shù)（Papp）的計(jì)算

以上公式中：腸道進(jìn)出口灌流液的體積（ml）：Qin和Qout（經(jīng)過(guò)密度校正）；腸道進(jìn)出口灌流液中藥物的濃度（mg/L）：Cin和 Cout；被灌流腸段的長(zhǎng)度（cm）和橫截面半徑（cm）：l和r；灌流速度（ml/min）：Q；灌流腸段的體積（cm3）：V。

4.3 密度的校正

收集45～105 min的灌流液，并記錄總體積與總重量，計(jì)算收集液的密度。 結(jié)果為(1.45±2.16)g/ml（n=10）。

4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 15.0處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行方差分析（ANOVA）。采用t檢驗(yàn)考察組間差異。

5 影響藥物腸吸收的因素

5.1 不用腸段對(duì)腸吸收的影響

取6只大鼠，每只大鼠分別取10 cm十二指腸段（自幽門(mén)下1 cm處開(kāi)始）、空腸段（自幽門(mén)15 cm處開(kāi)始）、回腸段（自盲腸上行20 cm處）和結(jié)腸（緊鄰盲腸至結(jié)腸）。稱(chēng)取適量白芍提取物并用K氏液配制成芍藥苷濃度為9.96 mg/L灌流液，灌流速度：0.2 ml/min，每15分鐘換液，持續(xù)時(shí)間：105 min，計(jì)算并比較各腸段下的Ka和Papp值并取后5組數(shù)據(jù)的平均值，見(jiàn)表1。

表1 不同腸段對(duì)藥物Ka和Papp的影響（±s,n=6）

表1 不同腸段對(duì)藥物Ka和Papp的影響（±s,n=6）

腸段 Ka(×10-2/min)1.69±1.23 1.72±0.63 1.78±2.02 1.70±1.03十二指腸空腸回腸結(jié)腸Papp(×10-3cm/min)5.75±1.42 5.67±0.58 5.32±1.71 5.57±0.79

從結(jié)果表明芍藥苷在十二指腸段、空腸段、回腸段與結(jié)腸段藥物的Ka和Papp之間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。提示芍藥苷在全腸道均有吸收，且小腸內(nèi)無(wú)特定吸收部位。

5.2 藥物濃度對(duì)腸吸收的影響

以K氏液為溶劑，取適量白芍提取物，制備成濃度分別為5.52、9.96、21.43 mg/L的芍藥苷供試液，選取腸道實(shí)驗(yàn)方法同“3.1”項(xiàng)下，以0.2 ml/min對(duì)空腸進(jìn)行灌流，每隔15 min取樣，取樣點(diǎn)為7個(gè)，分別計(jì)算各點(diǎn)的Ka和Papp值，對(duì)5組數(shù)據(jù)計(jì)算平均值，見(jiàn)表2。

表2 不同藥物濃度下的Ka和Papp（±s,n＝6）

表2 不同藥物濃度下的Ka和Papp（±s,n＝6）

5.52 9.96 21.43芍藥苷濃度（μg/ml） Ka(×10-2/min)1.72±1.61 1.79±2.28 1.76±1.34 Papp(×10-3cm/min)5.64±2.74 5.31±1.69 5.76±1.53

結(jié)果發(fā)現(xiàn)考察范圍內(nèi)芍藥苷的濃度對(duì)Ka和Papp無(wú)明顯影響（P＞0.05）。表明芍藥苷吸收入體循環(huán)的主要機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。

5.3 灌流速度對(duì)腸吸收的影響

將6只大鼠隨機(jī)分成2組。以K氏液為溶劑，配制濃度為9.96 mg/L的芍藥苷溶液作為灌流液，腸道選取方法同“3.1”項(xiàng)下，對(duì)空腸進(jìn)行灌流，一組以下列灌流速度進(jìn)行灌流：0.2、0.4、0.8、1.0、0.8、0.4、0.2 ml/min， 且每種流速均維持45 min，取樣間隔為15 min，在更換下一流速后應(yīng)先進(jìn)行平衡10 min后再進(jìn)行取樣，以消除誤差；另一組同法操作，灌流速度如下：1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml/min，分別計(jì)算每個(gè)取樣點(diǎn)的Ka和Papp值，考察灌流速度對(duì)Ka和Papp的影響，見(jiàn)表3。

表3 灌流速度對(duì)藥物Ka和Papp的影響（±s,n＝6）

表3 灌流速度對(duì)藥物Ka和Papp的影響（±s,n＝6）

0.2 0.4 0.8 1.0灌流速度（ml/min） Ka（×10-2/min）1.68±1.78 1.98±1.44 2.52±2.12 2.95±2.32 Papp（×10-3cm/min）5.32±1.69 8.65±2.12 11.3±2.07 14.1±1.46

結(jié)果表明，灌流速度影響著藥物的吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)（P＜0.01）。灌流速度與Ka和Papp值呈線性關(guān)系（r＞0.97）。提示可能隨著灌流速度的增大，對(duì)腸道沖洗作用增強(qiáng)，導(dǎo)致腸壁細(xì)胞脫落增加，使腸道厚度降低，更有利于藥物的擴(kuò)散，所以導(dǎo)致Ka和Papp值的增大。

6 討論

在體、體內(nèi)和離體法為目前國(guó)內(nèi)研究藥物腸吸收的方法，在體法是較多的采用方法，由于灌流液體積的變化是因?yàn)槟c道對(duì)水分有部分吸收導(dǎo)致，國(guó)內(nèi)曾把標(biāo)識(shí)物選為不被腸吸收的酚紅，來(lái)標(biāo)識(shí)灌流液體積的變化[13]，但腸也吸收了小部分的酚紅，從而對(duì)某些藥物的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)和分析測(cè)定產(chǎn)生了干擾。相比較于傳統(tǒng)的標(biāo)記物法，采用重量法可以顯著減少影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的干擾因素，并且消除了腸道吸收水分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。同時(shí)通過(guò)對(duì)密度的校正，可以看出假定收集液密度為1.0 g/ml存在一定誤差，實(shí)際實(shí)驗(yàn)值為（1.45±2.16）g/ml（n=10），要略高于假定值。導(dǎo)致密度增加的原因可能為：腸道內(nèi)仍存在殘留物，沖洗不徹底；在灌流過(guò)程中，灌流液可能會(huì)使腸道壁細(xì)胞溶蝕或黏膜脫落等。藥物難以吸收和易于吸收都用 Kappa值表示，當(dāng) Kappa＜0.03×10-4和 ＞0.2×10-4cm/s時(shí)分別為藥物難以吸收和易于吸收[12]，實(shí)驗(yàn)所測(cè)各腸段品也用Kappa值表示，當(dāng) Kappa為（0.000 281±1.63） cm/s表明腸道吸收較少量的芍藥苷，可能是芍藥苷有較好的水溶性，難以透過(guò)腸道表皮細(xì)胞，吸收過(guò)程有所限制，從而吸收少。

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