李天禹 ，何清湖 ，盧芳國 ，劉朝圣 ，萬 勝

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，貴州 遵義 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2008級博士研究生班，湖南 長沙 410208）

雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型的研究

李天禹1，何清湖2*，盧芳國2，劉朝圣2*，萬 勝3

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，貴州 遵義 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2008級博士研究生班，湖南 長沙 410208）

目的 研究雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型，為調(diào)理男性腎陽虛亞健康找尋科學(xué)配方。方法 控制用藥劑量及灌胃時間，用維生素B4建立雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型，檢測腺垂體－睪丸軸激素、氧化損傷因子及抗氧化損傷因子、睪丸組織微細(xì)結(jié)構(gòu)作為判斷亞健康組織學(xué)依據(jù)。結(jié)果 與正常大鼠相比較，模型大鼠血清FSH、LH、T均降低，均有統(tǒng)計學(xué)意義；模型大鼠血清SOD下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MDA增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型大鼠睪丸組織曲細(xì)精管規(guī)則，管腔變大，精子尾部有融合現(xiàn)象，生精細(xì)胞層次減少，排列較紊亂，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。結(jié)論 運用維生素B4建立的雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型成功。

腎陽虛；亞健康；維生素B4；大鼠

亞健康狀態(tài)是介于疾病與健康的身體低質(zhì)狀態(tài)。男性因其生理特點決定其亞健康狀態(tài)在中醫(yī)分型中主要體現(xiàn)為腎陽虛證。目前就男性亞健康模型的建立還沒有報道，對男性亞健康的調(diào)理校正還沒有行之有效的辦法。探討調(diào)理男性亞健康方法，建立雄性“腎陽虛”大鼠亞健康模型勢在必行。根據(jù)亞健康的概念及亞健康的判斷標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，特嘗試運用維生素B4建立雄性“腎陽虛”大鼠亞健康模型，現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用 20只清潔級 Sprague-Dawley雄性SD雄性大鼠，體質(zhì)量20 g，4月齡，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗室提供，合格證書：醫(yī)動字第04057號。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分成兩組：正常組及“腎陽虛”亞健康模型組，每組10只。

1.1.2 藥物 維生素 B4（10 mg/片×100），浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司（生產(chǎn)批號：20090317）。

1.1.3 試劑 卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）－放免分析藥盒（北京科美東雅生物技術(shù)有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）－ELISA試劑盒（購于北京中山生物技術(shù)有限公司，美國R＆D公司產(chǎn)品）。

1.1.4 儀器 MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司產(chǎn)品）；Olympus光學(xué)顯微鏡（臺灣）；RM2125石蠟切片機（德國 Leica公司產(chǎn)品）；AG204電子天平（瑞士梅托勒電子電器公司生產(chǎn)）；SORVALL Biofuge fresco 4℃離心機（德國）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 維生素B4研末，用生理鹽水溶解，配制濃度為1%?！澳I陽虛”亞健康模型組大鼠灌胃劑量為 0.1 g/（kg·d），連續(xù) 10 d。正常組大鼠按2 mL/只灌胃生理鹽水，連續(xù)10 d。

1.2.2 血清SOD活性、MDA含量的檢測 各組大鼠麻醉后經(jīng)腹主動脈取血約2 mL離心 (2 000 r/min)10 min，吸取血清采用ELISA法檢測大鼠血清SOD、MDA的吸光值。運用ELISACalc工具將標(biāo)準(zhǔn)濃度及相關(guān)吸光值輸入計算，再輸入相關(guān)血清吸光值，計算出SOD活性、MDA含量。

1.2.3 血清FSH、LH、T濃度的檢測 各組大鼠麻醉后經(jīng)腹主動脈取血約2 mL離心 (2 000 r/min)10 min，吸取血清送湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院同位素科采用放免法檢測FSH、LH、T的濃度。

1.2.4 睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 各組大鼠麻醉后剖腹，取一側(cè)睪丸，加入10%中性福爾馬林液固定；常規(guī)石蠟包埋。Leica石蠟切片機連續(xù)切片，片厚5 μm，取蠟帶貼于涂有蛋白甘油的載玻片上。常規(guī)蘇木精－伊紅染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對各組大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響

與正常組相比較，“腎陽虛”亞健康模型組大鼠活性降低(P＜0.05)，血清MDA含量增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明“腎陽虛”亞健康模型組大鼠抗氧化損傷作用降低，氧化損傷因素增強。結(jié)果見表1。

表1 維生素B4對大鼠血清SOD活性及MDA 含量的影響 （）

表1 維生素B4對大鼠血清SOD活性及MDA 含量的影響 （）

注:與正常組比較 *P＜0.05，◆P＜0.01。

組 別 n SOD(U/L) MDA(nmol/L)正常組 10 7.91±0.124 1.70±0.12模型組 10 5.59±1.66* 2.76±0.38◆

2.2 對各組大鼠血清FSH、LH、T濃度的影響

與正常組相比較，“腎陽虛”亞健康模型組大鼠血清 FSH(P＜0.01)、LH(P＜0.05)、T(P＜0.05)濃度均降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示“腎陽虛”亞健康模型組大鼠腺垂體－睪丸軸各內(nèi)分泌激素均降低。結(jié)果見表2。

2.3 對各組大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的變化

正常大鼠睪丸曲細(xì)精管形態(tài)規(guī)則，各級生精細(xì)胞、精子層次分明(A，B)?！澳I陽虛”亞健康模型組大鼠睪丸細(xì)胞僅處于變性階段：曲細(xì)精管規(guī)則，管腔變大，出現(xiàn)精子尾部融合現(xiàn)象明顯，各級生精細(xì)胞層次減少，排列較紊亂，有空泡現(xiàn)象出現(xiàn)，但沒有出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮、碎裂、溶解等壞死現(xiàn)象(C，D)。見圖1。

表2 維生素B4對大鼠血清FSH、LH、T濃度的影響（）

表2 維生素B4對大鼠血清FSH、LH、T濃度的影響（）

注:與正常組比較 *P＜0.01，◆P＜0.05。

組 別 n FSH(mIU/mL) LH(mIU/ML) T(ng/DL)正常組 10 4.56±0.52 4.51±1.71 0.26±0.05模型組 10 3.12±0.85* 2.52±1.02◆ 0.07±0.05◆

圖1 正常大鼠和“腎陽虛”亞健康模型大鼠睪丸組織比較（H.E.染色）

3 討論

亞健康的界定標(biāo)準(zhǔn)：①排除疾病源因素的疲勞和虛弱狀態(tài)；②介于健康與疾病之間的病前狀態(tài)(中間狀態(tài))；③在生理、心理、社會適應(yīng)能力和道德上的欠完美狀態(tài)；④與年齡不相稱的組織結(jié)構(gòu)和器官生理功能的衰退狀態(tài)[2]。在亞健康狀態(tài)下，線粒體功能障礙，產(chǎn)生大量過氧化產(chǎn)物如MDA，大量消耗SOD等酶類[3]。亞健康的建?，F(xiàn)在采用的是疲勞、睡眠剝奪、應(yīng)激方法[4]，不能反映諸如形寒肢冷之類的“腎陽虛”亞健康表現(xiàn)。目前腎陽虛亞健康動物的造模方法，有干擾內(nèi)分泌軸功能之嫌、無疾病狀態(tài)及亞健康狀態(tài)的明確界定[5]。選擇維生素B4建立雄性大鼠“腎陽虛”亞健康模型，控制用藥劑量及建模時間，既可確保腎陽虛證出現(xiàn)又可保證組織細(xì)胞變性而無結(jié)締組織變性及細(xì)胞壞死，即同時滿足了腎陽虛證的判斷標(biāo)準(zhǔn)和亞健康的界定標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。腎陽虛證人群中，血清FSH、LH、T均較正常人群顯著降低[6]；腎陽虛模型小鼠血清SOD活性下降、MDA濃度升高[7]；維生素B4致腎陽虛大鼠睪丸組織萎縮、各級生精細(xì)胞變性、數(shù)量減少，精子產(chǎn)生明顯減少（P＜0.01）[3]。

運用維生素B4建立腎陽虛亞健康模型，其結(jié)果顯示：模型大鼠血清FSH、LH、T濃度均降低，出現(xiàn)腎陽虛證類似的內(nèi)分泌激素改變結(jié)果；血清SOD水平下降及MDA濃度升高、睪丸組織細(xì)胞有變性改變，與腎陽虛證文獻報道結(jié)果相似?？紤]是因為維生素B4直接降低17β－羥類固醇脫氫酶的活性，將雄烯二酮還原為T能力減弱，導(dǎo)致T合成減少[8]；通過腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)影響睪丸、下丘腦、腺垂體等器官組織血液循環(huán)來損害相應(yīng)器官[9]，或者下調(diào)下丘腦、腺垂體對相應(yīng)促激素、促激素釋放激素；維生素B4代謝產(chǎn)物使組織中與糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的多種酶活性受抑制，影響了各組織的能量代謝所致[5]。根據(jù)組織損傷特點，引起細(xì)胞變性因素去除后，細(xì)胞形態(tài)和功能恢復(fù)正常，說明睪丸組織損傷處于可逆階段，提示維生素B4建立的“腎陽虛”雄性大鼠亞健康動物模型是成功的：達(dá)到腎陽虛證的內(nèi)分泌激素紊亂、氧化損傷增強及抗氧化損傷因素減弱的標(biāo)準(zhǔn)[3]，睪丸組織病理損傷僅在變性程度。

[1]孫 濤，王天芳，武留信.亞健康學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：9.

[2]林本榮，俞守義，勵建安，等.亞健康的診斷、分型與干預(yù)措施［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（8）：756－758.

[3]盧文麗，方肇勤.陽虛證動物模型診斷指標(biāo)與評析［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（4）：42－45.

[4]馬作峰，張六通，黃圣光，等.亞健康狀態(tài)大鼠模型的研制［J］.湖北中醫(yī)雜志，2008，30（6）：7－8.

[5]肖 靜，何立群，高建東，等.腺嘌呤與氫化可的松大鼠腎陽虛模型造模方法比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（3）：77－80.

[6]郭文娟，亞惠芳，張登本.腎陰虛證現(xiàn)代研究的回顧［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，26（3）：49－52.

[7]楊裕華，李 震.補腎中藥對腎陽虛動物模型神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)影響的實驗研究進展[J].天津中醫(yī)藥，2007，24（3）：262－264.

[8]馬 靜，張遠(yuǎn)強，王宗仁，等.腺嘌呤致大鼠雄性不育發(fā)病機理的實驗研究［J］.解剖學(xué)報，2005，36（3）：278－283.

[9]Adachi Y， Nakada T.Effect of experimentally induced renal failure on testicular testosterone synthesis in rats ［J］.Aron Androl，1999，43（1）：37－45.

（本文編輯 彭芝配）

Study on sub-health model of male Kidney-yang deficiency in rats

LI Tian-yu,HE Qing-hu,LU Fang-guo,LIU Chao-seng,WAN Sheng
(Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,China)

Objective To explore the sub-health model of male Kidney-yang deficiency in rats and look for a method for regulation of male Kidney-yang deficiency in human.Method Vitamin B4was used to set up the sub-health rats model of male Kidney-yang deficiency,the level of anterior pituitary-testiculus axle hormone,the content of oxidative damage factors and anti-oxidative damage factors, the fine structure of testicle tissue were detected to measure histological baseness in sub-health condition.Result Compared with normal rats,the levels of FSH,LH,T and SOD were decreased(P＜0.05),and content of MDA was increased(P＜0.01).the seminiferous tubule structure of testicle tissue was neat but lumen was expanded.There were the part-fusing in sperm tail,spermatogenic cell-staging decreased,ranged abnormal and existed the vacuolus. Conclusion Vitamin B4can be used to establish the sub-health model.

Kidney-yang deficiency;sub-health;vitamin B4;rats

* 劉朝圣，男，湖南瀏陽人，副教授，博士，E-mail：chaoliu2807@sina.com。

R-332

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.006.022.03

2010－05－19

湖南省教育廳科學(xué)研究青年項目（08B057）；湖南省研究生科研創(chuàng)新基金項目（CX2009B173）。

李天禹（1966－），男，貴州遵義人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合男性病的研究。