張 翠,賈法玲
(泰山學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系,山東 泰安 271021)
肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一,在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率和死亡率呈迅速上升趨勢(shì)且臨床治療效果不佳[1].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)中藥在腫瘤的預(yù)防和治療方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),臨床常用的治療肺癌的有效偏方均為多種中藥聯(lián)合使用,每味中藥的作用機(jī)制尚不明確[2].泰山四葉參(Codonopsis lanceolata Benth.et Hook.F.),根入藥,具有清熱解毒、止咳祛痰、補(bǔ)虛通乳、健身補(bǔ)氣等功效,系泰山四大名藥之一[3],其對(duì)肺癌的作用及機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道.烏拉坦(又稱氨基甲酸乙酯,烏來(lái)糖)是有機(jī)合成和分析常用試劑,能誘發(fā)多種小鼠、大鼠產(chǎn)生肺癌[4-10],本文首先對(duì)泰山四葉參對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌的作用及可能的作用機(jī)理展開(kāi)初步研究,旨在為四葉參預(yù)防和治療肺癌提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).
野生四葉參購(gòu)自泰安市東方泰山天然藥用植物研究所.烏拉坦(Urethan):稱取10g溶于100ml生理鹽水中,4℃保存?zhèn)溆?環(huán)磷酰胺(CTX,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司),SOD測(cè)試盒(購(gòu)自南京建成).其他化學(xué)試劑均為分析純.
將干泰山四葉參加入四倍蒸餾水煎煮1h,藥渣同法再煎煮兩次,過(guò)濾,將三次煎煮液混合并濃縮至濃度為180g(生藥)/100ml、90g(生藥)/100ml、45g(生藥)/100ml,4℃保存?zhèn)溆?
六周齡昆明種雌性小鼠,體重約(20±2)g,購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第88醫(yī)院.
1.3.1 模型建立與分組
將小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,分為陰性對(duì)照組、預(yù)防組、陽(yáng)性對(duì)照組和泰山四葉參多糖低、中、高濃度組.無(wú)菌條件下連續(xù)腹腔注射0.1ml10%烏拉坦28天,誘導(dǎo)其產(chǎn)生肺癌(隨機(jī)抽取各組小鼠對(duì)肺進(jìn)行觀察,若用肉眼或解剖鏡下觀察到肺部有略突出表面的圓色灰白色小點(diǎn),即為腫瘤[7-9]),預(yù)防組同時(shí)每天給予0.1ml 90%泰山四葉參.之后停止注射烏拉坦,按腫瘤(陰性)對(duì)照組(0.1m l生理鹽水· d-1)、CTX(陽(yáng)性)對(duì)照組(0.1ml 0.2%CTX·d-1)、低濃度組(0.3ml 45%泰山四葉參·d-1)、中濃度組(0.3ml 90%泰山四葉參·d-1)、高濃度組(0.3ml 180%泰山四葉參·d-1)給藥,預(yù)防組繼續(xù)灌胃給予泰山四葉參熬煎劑.
1.3.2 對(duì)小鼠生存狀態(tài)及存活時(shí)間的影響
按上述方法連續(xù)給藥15d,每天記錄小鼠體重變化及生存狀況,停藥后記錄每組每只小鼠的生存時(shí)間,體重增長(zhǎng)率和生命延長(zhǎng)率按以下公式計(jì)算:
體重增長(zhǎng)率(%)=[(小鼠平均終體重—小鼠平終始體重)/小鼠平均始體重]×100
生命延長(zhǎng)率(%)=[(藥物處理組小鼠平均存活時(shí)間—陰性對(duì)照組小鼠平均存活時(shí)間)/陰性對(duì)照組小鼠平均存活時(shí)間]×100.
1.3.3 小鼠胸腺、脾、肺、肝臟指數(shù)測(cè)定及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn)
按分組連續(xù)給藥8d,第9天時(shí)眼球取血后將小鼠斷頸處死,稱取胸腺、脾、肺重量,計(jì)算其指數(shù).內(nèi)臟指數(shù)計(jì)算公式如下:
小鼠連續(xù)灌胃給藥8d后,連續(xù)2天腹腔注射5%蛋白胨溶液0.5ml,兩天后,腹腔注射用生理鹽水配成的5%(V/V)雞紅細(xì)胞懸液,誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞.1h后處死,解開(kāi)腹壁皮膚,制作巨噬細(xì)胞吞噬涂片[11],晾干后油鏡下觀察計(jì)數(shù).按照下式計(jì)算吞噬指數(shù):
吞噬指數(shù)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)÷100個(gè)巨噬細(xì)胞.
1.3.4 血清、肺、肝臟中SOD活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)
小鼠摘除眼球采血,滴入干燥干凈的采血管中,室溫靜置1~2小時(shí),2000rpm離心10min,取上層得血清.制備肺、肝臟組織勻漿液,按總超氧化物歧化酶(T-SOD)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血漿、肝臟、肺的T-SOD活力.
所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS12.0進(jìn)行分析,組間差異顯著性采用t檢驗(yàn).
每日稱取小鼠體重并觀察各組生長(zhǎng)狀況,停藥后記錄其生存時(shí)間,結(jié)果見(jiàn)表1:
表1 泰山四葉參對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)肺癌小鼠生存時(shí)間的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用藥組體重明顯高于腫瘤對(duì)照組小鼠體重,中濃度用藥組體重比低濃度用藥組、高濃度用藥組增長(zhǎng)快,CTX對(duì)照組小鼠體重比用藥組略低.預(yù)防組、高濃度組和CTX對(duì)照組延長(zhǎng)了烏拉坦誘導(dǎo)肺癌小鼠的存活時(shí)間且差異極顯著.
測(cè)定小鼠胸腺、肺、脾及吞噬指數(shù),結(jié)果見(jiàn)表2:
表2 泰山四葉參對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)肺癌小鼠臟器指數(shù)及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響
由表2可以看出預(yù)防組和中高濃度組可明顯提高烏拉坦誘導(dǎo)肺癌小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和吞噬指數(shù),且差異極顯著,CTX對(duì)照組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和吞噬指數(shù)明顯降低;但各組的肺指數(shù)均有所降低.除此之外,實(shí)驗(yàn)中觀察到正常小鼠肺呈淺紅色,顏色鮮艷,而腫瘤對(duì)照組肺呈暗紅色,表面有灰白色圓點(diǎn),用藥組灰色圓點(diǎn)較少,低、中、高三濃度用藥組肺部形態(tài)無(wú)顯著差異.
對(duì)各組小鼠血清、肺、肝臟SOD測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表3:
表3 泰山四葉參對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)肺癌小鼠血清、肺、肝SOD活性的影響
根據(jù)表3所測(cè)數(shù)據(jù)比較各組小鼠血清、肝臟及肺臟中SOD活性,發(fā)現(xiàn)預(yù)防組、高濃度用藥組和CTX對(duì)照組顯著高于腫瘤對(duì)照組,其中高濃度組和CTX對(duì)照組血清中SOD活性差異極顯著,肝臟和肺臟中差異顯著.
肺癌在我國(guó)的發(fā)病率正迅速上升,并且由于現(xiàn)有的治療手段療效較差,導(dǎo)致其死亡率占惡性腫瘤的首位,除了在日常生活中建議大家不要抽煙、拒絕二手煙之外,尋找更加安全、有效的藥物仍然是亟需解決的問(wèn)題.
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)記錄各組小鼠體重變化、生長(zhǎng)狀況和生存時(shí)間驗(yàn)證了泰山四葉參對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)肺癌小鼠有一定預(yù)防和治療作用,其效果是否與泰山四葉參濃度有關(guān)尚未有明確證據(jù).通過(guò)檢測(cè)小鼠體內(nèi)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活性,觀察小鼠肺、脾、胸腺形態(tài)以及測(cè)定小鼠肺、脾、胸腺指數(shù)[11]不難發(fā)現(xiàn),泰山四葉參有提高機(jī)體免疫力的作用,這與其他研究者的結(jié)論基本一致[12].泰山四葉參增強(qiáng)了免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞的吞噬能力,顯著提高了胸腺、脾臟指數(shù),同時(shí)降低了肺指數(shù),說(shuō)明其在增強(qiáng)小鼠免疫力的同時(shí)對(duì)肺癌有一定的治療作用,我們認(rèn)為其抑癌機(jī)制可能與此有關(guān).相較于傳統(tǒng)化療藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫抑制作用(如CTX),泰山四葉參為代表的中藥在新的抗肺癌藥物研發(fā)中具有較大優(yōu)勢(shì)[13].
研究通過(guò)測(cè)定各組小鼠血清、肺、肝臟SOD活性,可以看出泰山四葉參水煎劑具有較強(qiáng)的抗氧化能力,可以激活小鼠體內(nèi)SOD活性,通過(guò)清除過(guò)氧化物損傷達(dá)到預(yù)防、治療肺癌的效果.同時(shí)通過(guò)及時(shí)消除體內(nèi)過(guò)氧自由基延緩或消除機(jī)體疲勞[14],改善小鼠的生存狀態(tài),有利于改善肺癌治療過(guò)程中的毒副作用[15].
本研究說(shuō)明泰山四葉參對(duì)烏拉坦誘發(fā)的小鼠肺癌有一定預(yù)防、治療作用,并能提高小鼠的生存質(zhì)量,延長(zhǎng)其生存時(shí)間,主要的機(jī)制可能與其免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用有關(guān).但其具體的分子機(jī)制仍需做進(jìn)一步探討.
泰山四葉參資源豐富,對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)有重要的意義:一方面可積累更多的理論知識(shí),另一方面也可以此為基礎(chǔ)利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)從傳統(tǒng)中藥中篩選出新的天然抗肺癌的藥物[16],對(duì)宣傳泰山,使中藥走向世界具有重要意義.
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